庞金辉,刘明轩,石文俊,樊海峰,陈贤奇,唐桐生,曹成福

(上海中医药大学附属普陀医院骨科,上海,200062)

膝骨关节炎(OA)因其发病机理尚未完全明确,目前无法有效治愈。研究表明,在OA患者的关节软骨中,软骨细胞和各种细胞外基质均发生显著的改变,由胶原和蛋白聚糖所组成的网络状结构亦出现降解,从而导致了关节软骨的进一步退化。本实验通过对膝OA和正常人关节软骨中X型胶原的检测,分析OA患者X型胶原的表达特征,以探讨X型胶原在膝骨关节炎进展中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 标本情况

收集行人工膝关节置换术患者的软骨标本18例,所有病例均排除继发性OA或类风湿关节炎等其他关节疾病,确诊为原发性OA(诊断标准参考美国风湿病学会1995年版指南),其中女14例,男4例,平均年龄 68.3岁(61～79岁)。正常对照组13例 ,女性9例 ,男性4例 ,平均年龄65.1岁(57～81岁),来源于大腿及以上部位截肢术患者或捐献的新鲜尸体,均无关节疾患。

1.2 实验方法

1.2.1 HE染色:各组标本取下后,去除碎屑,生理盐水冲洗,仔细观察大体情况,取部分做HE染色,其余标本置于-70℃冻存待用。

1.2.2 总RNA抽提:将软骨组织块充分剪碎,PBS洗涤,加入0.2%的Ⅱ型胶原酶/0.1%透明质酸酶的DMEM溶液中,于37℃震荡消化4～6 h,500 g离心获取软骨细胞。取软骨细胞加入Trizol(GIBCO BRL)中,按照实验说明抽提总RNA。余下细胞冷冻备用。

1.2.3 RT-PCR:按照试剂盒说明,将mRNA反转录为 cDNA(2 μ L RNA/20 μ L 体系 ,TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL)。以得到的cDNA为模板进行PCR反应(TaKaRa Taq),以βactin为内标基因。X型胶原的引物序列如下:正义链 5′-TGGGTAGGCCTGTATAAAGAACGG-3′;反 义 链 5′ -CATGGGAGCCACTAGGAATCCTGAGA-3′。X型胶原基因扩增反应条件:94℃变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,反复循环,最后72℃延伸10 min。……