田 影，尤胜义，李 楠，张朝晖

实验研究

参芪扶正注射液对重症急性胰腺炎大鼠心肌保护的作用

田 影1，尤胜义2，李 楠2，张朝晖1

目的：探讨参芪扶正注射液对SAP大鼠心肌保护的作用及机制。方法：清洁级雄性SD大鼠26只随机分为3组：K组为假手术组；M组为仅建立SAP大鼠模型组；S组为造模后予腹腔注射中药参芪扶正注射液。观察3组大鼠术后24 h血清肌酸磷酸肌酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌细胞Na+-K+-ATPase活性、线粒体膜电位及心肌细胞凋亡指数，并对心脏及胰腺组织行病理学检查。结果：S组大鼠血清CK-MB、LDH、胰腺及心脏病理评分和心肌细胞凋亡指数均低于M组(P＜0.01)，但高于K组(P＜0.01)，S组Na+-K+-ATPase活性、线粒体膜电位没有降低的细胞比例高于M组(P＜0.05)，但低于K组(P＜0.01)。结论：参芪扶正注射液对SAP引起的心肌损伤有保护作用。

参芪扶正注射液；重症急性胰腺炎；大鼠；心肌保护

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常并发多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其胰外器官损伤中，心功能障碍(胰心综合征)较为常见，心血管失代偿是导致病死率最高的并发症[1]。本研究旨在观察参芪扶正注射液对大鼠SAP及其心肌损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制作 健康清洁级雄性SD大鼠26只，体质量200～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。随机分为：假手术组(K组，6只)、SAP模型组(M组，10只)、参芪扶正注射液治疗组(S组，10只)。M组和S组均采用5%牛磺胆酸钠胆胰管内逆行注入的方法制作SAP动物模型；K组开腹后，翻动胰腺数次后关腹，不注射牛磺胆酸钠。S组按中药2.5 mL/100g体质量，分2次分别于造模后8 h和16 h腹腔注射；K组和M组于相同时间点给予等量生理盐水腹腔注射。

1.2 主要试剂 参芪扶正注射液（丽珠集团利民制药厂，规格为250 mL，含党参和黄芪各10 g）；牛磺胆酸钠（北京奥博星生物技术责任有限公司，用生理盐水配制成浓度为5%的溶液）；超微量ATPase检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量试剂盒（北京盖宁金诺生物技术有限责任公司）；心肌线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术研究所）；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。

1.3 检测指标与方法 各组大鼠于术后24 h麻醉活杀，无菌条件下开腹。观察腹部情况，腹主动脉取血。动脉血于室温放置1 h待自然凝固，4℃3000 r/min离心10 min，收集血清。血清标本置于-80℃冰箱中保存，以备集中检测血清CK-MB、LDH水平。无菌条件下开胸取心脏，将心脏放在一个置于冰上的培养皿中，分三份：一份用于组织匀浆制备，应用分光光度法检测Na+-K+-ATPase活性；一份用于分离心肌细胞线粒体，检测线粒体膜电位（用0.5 mL LPBS悬浮线粒体，在线粒体悬液中加入10 μL罗丹明123工作液，37℃5%CO2培养箱中避光孵育15 min，混匀，设定激发波长488 nm、发射波长525 nm，流式细胞仪检测荧光强度）。将余部分心脏及部分胰腺，置于4%多聚甲醛中固定，石蜡切片，HE染色。TUNEL法标记心肌凋亡细胞，计算凋亡指数（Apoptosis Index,AI=心肌细胞凋亡数/心肌细胞总数×100%）。由专业病理医师阅片，行SAP胰腺及心脏病理评分，评分标准参见文献[2-3]。

1.4 统计学处理 死亡率统计采用四格表确切概率法；所有检测数据以均数±标准差（±s）表示，并应用SPSS 13.0统计软件进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，以P＜0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠术后一般情况 K组大鼠术后一般情况较好。M组大鼠术后一般状况较差，出现竖毛、懒动、精神萎靡、反应迟钝、呼吸急促等表现，24 h死亡率为30%。S组一般状况较M组有改善，24 h死亡率为10%，与M组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 血清指标 与K组相比，M组血清CK-MB、LDH含量均明显增加（P＜0.01）。S组CK-MB、 LDH含量虽然高于K组，但较M组比较明显降低(P＜0.01)。见表1。

表13组大鼠血清CK-MB和LDH水平(±s)

表13组大鼠血清CK-MB和LDH水平(±s)

注：与假手术组相比，aP＜0.01；与SAP组相比，bP＜0.01

分组假手术组SAP模型组参芪扶正液组n679 CK-MB(μ/mL) 639.33±37.72 2133.2±111.60a 1332.78±120.39a、b LDH(μ/L) 593.17±45.43 1873.71±141.86a 953.11±74.23a、b

2.3 心肌细胞Na+-K+-ATPase活性 M组心肌细胞Na+-K+-ATPase活性较K组明显降低（P＜0.01）；但S组Na+-K+-ATPase活性较高，与M组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 3组大鼠心肌细胞Na+-K+-ATPase活性(±s，U/mgprot)

表2 3组大鼠心肌细胞Na+-K+-ATPase活性(±s，U/mgprot)

注：与假手术组相比，aP＜0.01；与SAP组相比，bP＜0.01

分组假手术组SAP模型组参芪扶正液组n679 Na+-K+-ATPase活性10.65±0.96 4.62±0.51a8.06±0.73a、b

2.4 心肌线粒体膜电位 M组线粒体膜电位没有降低的细胞比例明显低于对照K组（P＜0.01）；S组心肌细胞线粒体膜电位明显高于M组（P＜0.05）。见表3。

表3 3组大鼠线粒体膜电位检测结果±s）

表3 3组大鼠线粒体膜电位检测结果±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.01；与SAP组相比，bP＜0.05

组别假手术组SAP模型组参芪扶正液组n679线粒体膜电位没有降低细胞所占百分率（%）95.13±1.94 45.59±2.97a66.61±3.99a、b

2.5 心肌细胞凋亡指数 普通光学显微镜下观察，凋亡细胞细胞核呈棕黄色，非凋亡细胞和阴性对照被苏木精复染呈蓝色。K组心肌细胞出现较少核呈棕黄色的凋亡细胞；M组则见较多棕黄色核的凋亡细胞。M组凋亡指数较对照组明显升高（P＜0.01）；与M组相比，S组凋亡指数明显降低（P＜0.01）。见表4。

2.6 组织病理学检查 光镜下，M组胰腺间质水肿明显、间质出血，可见出血、凝固性坏死和脂肪坏死，坏死区有大量中性粒细胞为主的炎细胞浸润，小叶轮廓破坏。S组胰腺病理损害较M组有不同程度的改善。M组心脏肌纤维严重变性、肿胀，大部分肌纤

表4 3组大鼠心肌细胞凋亡指数(±s）

表4 3组大鼠心肌细胞凋亡指数(±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.01；与SAP组相比，bP＜0.01

组别假手术组SAP模型组参芪扶正液组n679凋亡指数(%) 1.76±0.54 31.62±4.68a24.06±3.75a、b

维结构消失，有的肌膜已经破裂，肌纤维排列紊乱，血管充血，病理结果符合重症急性胰腺炎致心肌损伤的表现。S组肌纤维水肿、轻度变性，横纹模糊。

与K组相比，M组大鼠术后24 h胰腺和心脏病理评分明显升高(P＜0.01)；S组大鼠胰腺及心脏病理评分均明显低于M组(P＜0.01)。见表5。

表5 3组大鼠胰腺及心脏病理评分(±s）

表5 3组大鼠胰腺及心脏病理评分(±s）

注：与假手术组相比，aP＜0.01；与SAP模型组相比，bP＜0.01

组别假手术组SAP模型组参芪扶正液组n679胰腺1.67±0.82 12.14±1.35a6.33±1.41a、b心脏0 2.86±0.69a1.67±0.50a、b

3 讨论

重症胰腺炎是病情危笃、并发症和死亡率较高的外科急腹症。最新研究发现，胰腺的出血坏死除胰酶的组织溶解外，还包括以缺血为特征的胰腺微循环障碍，且其贯穿于胰腺炎的始终[4]。李欣志等[5]研究发现，参芪扶正注射液可明显减轻心肌缺血程度，缩小心肌缺血范围，显著增加缺血心脏的冠脉血流量，对心肌缺血及心肌梗塞引起的血清肌酸激酶活性升高有明显抑制作用。可减轻大鼠心肌缺血再灌注心肌损伤程度，明显缩小心肌梗塞面积，降低血清MDA含量，从而对犬和大鼠实验性急性心肌缺血具有明显的对抗作用。初期休克和胰腺缺血既是SAP的始动因子，又是SAP病情恶化的促进因素。初期休克不能单纯以胰周和腹腔内失液解释，还应考虑到血循环和腹腔液中存在胰酶，血管舒缓素缓激肽、组织胺和其他毒性物质，这些可造成全身广泛血管损伤。而胰腺血管的严重损伤可引起出血，内皮细胞分离和血栓形成，这些因素可促使和加重胰腺的出血坏死。因此，SAP早期纠正休克及胰腺出血，改善微循环，阻止病情进一步发展有至关重要作用。

参芪扶正注射液组方中药为党参和黄芪，具有：(1)强心作用。党参中含有多种氨基酸及多糖，能增强网状内皮系统功能，提高心排血量而不增加心率，其强心作用与强心苷类似，能改善心功能；党参含有人参皂苷，可阻滞细胞膜Ca负荷，防止Ca超载，减少心肌损伤，促进心肌细胞的修复[6]。黄芪含黄芪皂甙、黄芪多糖、黄酮类化合物等，通过调节Na+-K+-ATPase，使cAMP水解减少，从而增加胞内cAMP浓度而使心肌收缩增强振幅明显扩大，对心肌有正性肌力作用，对中毒或疲劳衰竭的心脏的作用更为明显。(2)抗心肌缺血作用，党参能较好地改善心肌的舒张功能，增强心肌的顺应性，使冠状动脉灌注阻力减小，有利于左心室心肌的血液供应，从而改善心肌缺血。黄芪可提高心肌抗氧化能力、消除自由基、减轻细胞膜脂质过氧化状态和维护细胞膜的完整性来防护心肌缺血再灌注损伤[7]。(3)免疫调节，增强机体抗病能力。黄芪中的黄芪多糖对免疫功能有显著的促进作用，能增强特异性和非特异性免疫功能，增加血液中的白细胞总数，促进中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬功能和杀菌能力，黄芪也增强细胞免疫[8]。

为进一步深入探讨参芪扶正注射液保护重症急性胰腺炎心肌损伤的机制,本实验通过研究参芪扶正注射液对血清CK-MB、LDH和心肌Na+-K+-ATPase活性、线粒体膜电位、心肌细胞凋亡等的影响,为中药保护SAP心肌损伤的研究提供更为有力的依据。实验结果表明，参芪扶正注射液可部分抑制SAP大鼠心肌损伤时血清CK-MB、LDH的溢出，降低血清CK-MB、LDH的活性，初步证实了参芪扶正注射液可明显增加SAP大鼠冠脉血流量，促进侧支循环开放和建立，同时增加心肌的供氧。参芪扶正注射液治疗组心肌细胞Na+-K+-ATPase活性增强，显示参芪扶正注射液可通过保存细胞内Na+-K+-ATPase酶活性从而防止内钙超载、维持基质体积稳定来实现强心作用，显著提高左室收缩功能，使心脏搏血量增加。参芪扶正注射液治疗组大鼠线粒体膜电位没有降低的百分比、心肌细胞凋亡指数较SAP模型组明显升高，差别均有统计学意义。这提示参芪扶正注射液能稳定线粒体跨膜电位抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡，对SAP心肌具有明显保护作用。为SAP早期应用补气养血中药进行干预提供了理论依据。

[1]Pitchumoni CS,Agarwal N,Jain NK.Systemic complications of acute pancreatitis[J].Am J Gastroenterol,1988，83(6):597-606.

[2]许永春，李兆申，屠振兴，等.单核细胞趋化蛋白在重症急性胰腺炎发病机制中的作用[J].胰腺病学，2004,4（2）：94-97.

[3]虞敏，杨英珍，沈学东，等.高频超声心动图评价小鼠病毒性心肌炎模型的心功能改变 [J].中华超声影像学杂志，2001,10（1）: 54-56.

[4]Lehocky P,Sarr MG.Early enteral feeding in severe acute pancre⁃atitis:can it prevent secondary pancreatic(super)infection?[J].Dig Surg,2000,17(6):571-577.

[5]李欣志，尚晓泓，马晓斌，等．参芪扶正注射液对犬和大鼠实验性急性心肌缺血的影响[J].中国中医基础医学杂志，2003,9(9): 28-32．

[6]云美玲.参芪扶正注射液治疗慢性心力衰竭55例临床观察[J].海南大学学报(自然科学),2006,24(4):371-373.

[7]陆益，陆益线.参芪扶正注射液的药理作用和临床应用[J].时珍国医国药，2006，17(10):2083-2085.

[8]朱振东.参芪扶正注射液对老年慢性肺心病急性加重期免疫功能的影响[J].中国现代医学杂志，2005，15(16)：2522-2523.

（收稿：2011-12-20 修回：2012-08-22）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）

Myocardial Protection of Shenqi Fuzheng Injection in Rats with Severe Acute Pancreatitis

TIAN Ying,

YOU Sheng-yi,LI Nan et al. The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin(300150), China.

Objective To investigate the role of Shenqi Fuzheng Injection in rats with(severe acute pancre⁃atitis SAP)and its possible mechanism of myocardial protection. Methods Twenty Six healthy SD rats were randomly divided into 3 groups:K group was given sham operation;M and S groups were established SAP mod⁃el in rats;S group was treated by intraperitoneal injection of Shenqi Fuzheng Injection after operation.The levels of serum CK-MB,LDH,Na+-K+-ATPase activity,mitochondrial membrane potential and myocardial apoptosis were measured after 24 h.Pathologic changes of the pancreas and heart were also detected.Results The lev⁃els of serum CK-MB and LDH,the heart pathological scores and the myocardial apoptosis in S group were lower than those in M group(P＜0.01)but remain higher than those in K group(P＜0.01),while the Na+-K+-ATPase activity and mitochondrial membrane potential were higher than those in M group(P＜0.05)but remained lower than those in control group(P＜0.01). Conclusion Shenqi Fuzheng Injection had myocardial protective ef⁃fect in rats with SAP.

Shenqi Fuzheng Injection；severe acute pancreatitis；rats；myocardial protection

Q95-33；R657.5+1

A

1007-6948(2012)06-0577-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.06.012

1.天津中医药大学第二附属医院中医外科（天津 300150）

2.天津医科大学总医院中西医结合外科（天津 300052）

尤胜义，E-mail:shengyiyou@hotmail.com