李燕，崔杰鑫，赵文

(大连海洋大学水产与生命学院辽宁省水生生物重点实验室，辽宁大连116023)

近年来，刺参养殖业走上发展的快车道，迅速成为高经济效益的产业［1］，刺参的养殖密度也越来越高。过高的养殖密度给养殖水体带来了氮元素输入和产出的严重不平衡，导致水体氨态氮，亚硝酸态氮大量积累［2］。养殖水体中高浓度的氮元素极易引发刺参的病害和死亡，也严重破坏了养殖系统的氮循环平衡体系［3］。如何有效控制养殖水体的氮污染一直是水产养殖研究的重要问题之一，目前研究较多的是采用微生物方法［4-5］。本文综述了氨氮的危害、微生物对降解氨氮和微生物降解法的实际应用，并对该方法的应用前景进行了展望。

1 氨态氮对刺参的毒害

我国的刺参养殖多采用封闭式，随着养殖时间的增加，刺参的粪便、残饵、其他生物的排泄物以及一些浮游动植物的尸体不断在池塘底部积累，富集在池底的这些污染物在一定条件下会向养殖水体中释放无机氮如N、NO2--N，尤以-N的毒性为最大［3，6-7］。氮污染对刺参的毒性机制还不是很清楚，一般比较认同的解释是:氨态氮能通过刺参体表深入机体内，释放OH-，促使体液pH升高，对酶水解反应和膜稳定性产生显著影响，表现为呼吸困难、不摄食、抵抗力下降等现象导致刺参大批量死亡［8］;认为高浓度的氨态氮会取代刺参体内的钾离子，影响神经系统工作，引起N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合活性明显降低，导致中枢神经系统中流入过量的钙离子并引起细胞死亡［9］。刺参生活过程中也会以氨态氮的形式向环境中排泄氮元素，当外界水环境氨态氮含量过高时会抑制刺参的排泄，进而影响其自身的生长。

2 微生物对氨态氮的降解

微生物脱氮技术能够有效去除刺参养殖池塘中高含量的氮元素，具有十分重要的意义和极大的实用价值，尤其是在降解池塘氨态氮方面作用更大［10］。在养殖池塘中，微生物降解氨态氮过程主要发生在沉积物中，这个过程占据了整个养殖池塘氮循环的关键步骤［11］。微生物降解氨态氮的过程主要由两大类细菌完成:自养硝化细菌和异养硝化细菌。自养硝化细菌将水体中氨态氮转变为亚硝酸盐态氮和硝酸态氮，并从该氧化过程中获得能量，同化无机碳化合物CO32-、HCO3-和CO2，合成细胞物质［10］。自养硝化细菌降解氨态氮分2个相对独立而又联系紧密的阶段。前一阶段NH3氧化为NO2-，成为亚硝化作用或氨氧化作用，由亚硝化细菌完成;后一阶段是NO2-氧化为NO3-的过程，称为硝化作用，由硝化细菌完成。所以，常说的硝化作用实际上包括了上述2个阶段［11-12］。异养硝化细菌在某些特定的环境中进行化能异养，能分别将氨态氮和亚硝酸盐等氧化成亚硝酸盐和硝酸盐。异养硝化细菌可利用的氮源比较多，包括无机氮(NH3、NO2-)和有机氮(胺、酰胺、N-烷基羟胺、芳香硝基化合物等)，这是异养硝化细菌不同于自养硝化细菌的特点之一。正因为异养硝化细菌可以利用的氮源比较多，所以异养硝化作用的底物及其代谢途径至今仍不太清楚［10］。

3 高效氨氮降解菌株的筛选、鉴定和固定

自养硝化细菌生长缓慢，代谢周期较长，无法在有机物含量高的刺参池塘底泥中和异养菌竞争，这导致自养硝化细菌难以形成优势种群。同时，自养硝化细菌对外界环境的变化适应能力差，尤其对外界毒性冲击敏感，一旦自养硝化细菌的降解体系受到损害很难恢复［2，13］。因此，对水体环境要求高，生长速度缓慢，生物量小，难以快速处理水质急剧恶化问题，是自养硝化细菌难以在刺参养殖池塘的氨态氮降解上发挥重要作用的主要原因［14］。在降解养殖水体氨态氮方面，异养硝化细菌有其独特的优势。首先，异养硝化细菌生长速率快，能在短时间内成为池塘微生物生态系统中的优势种群，利用水体中的氨态氮［10］。其次，异养硝化细菌成为微生物生态系统中的优势种群后还能够与致病菌竞争空间、营养物质，产生胞外产物抑制病原菌的生长［14-16］。因此，如何筛选高效异养硝化细菌来降解养殖水体氨态氮成了近年来的研究课题。

3.1 高效降解菌株的来源

研究发现，某些陆生动物使用的益生菌可以应用于水产养殖［17］，但大部分学者认为，从刺参或其周围养殖环境中筛选的降解氨态氮的降解微生物是比较好的候选微生物［14，18］。目前，刺参养殖过程中使用的有降解氨态氮功能的益生菌多为外来菌株，大量使用将有可能导致外来菌种的入侵，破坏养殖池塘底部原本脆弱的微生物生态系统，进而引发其他病害。

3.2 高效降解菌株的筛选

对于任何一种具有降解氨态氮功能的有益微生物的筛选，如果筛选方法得当，可以大大减少筛选的工作量，并且不会发生漏选的问题［19］。对采集样品进行富集培养是微生物分离的关键步骤之一，其目的是淘汰样品中竞争能力和生命力弱的菌株，扩大具有强竞争能力菌株的生物量以方便复筛。淘汰样品中竞争能力弱的菌株可以保证筛选出的菌株应用于养殖水环境后发挥自身的竞争优势，通过营养竞争等快速繁殖以达到去除水体氨态氮的目的［20］。在一种候选菌被用做高效降解菌进行工厂化生产之前，有必要证实其对养殖生物没有毒害。因此，应在正常养殖条件下，用候选的高效降解菌对养殖生物进行攻毒实验，在确定其无致病性后，再进行工厂化生产，这是评价该菌株效果是否最佳的有效方法［16］。由于实际养殖环境中池塘底质各种物质含量和实验室培养基相差很大，实验室的环境条件和养殖环境差别也很大，这些都为候选微生物发挥降解作用增加了困难。所以，在实验室条件下筛选得到氨态氮高效降解菌株后有必要进行养殖环境的复筛［21］。

3.3 高效降解菌株的鉴定

一般来说，细菌的鉴定至少需要使用3种指标同时进行验证。传统的生理生化方法鉴定微生物需要测定的项目众多，工作程序繁琐，耗时长。分子生物学方法进行细菌鉴定速度快、工作量小，该方法虽然通过了相关权威组织的认可，但其稳定性尚存在一些问题，同时需要配合其他方法来相互印证，从而完成细菌的鉴定工作。所以，采用传统的生理生化方法和现代的分子生物学方法相结合来鉴定氨态氮高效降解菌株是比较科学的方法［22］。

3.4 高效降解菌株的固定

由于刺参的粪便、残饵、其他生物的排泄物以及一些浮游动植物的尸体不断在池塘底部积累，所以池塘底部是养殖水体中氨态氮的主要产生场所;另外，池塘底部积累的大量有机物和营养元素为有害微生物的繁殖提供了营养，这些有害微生物的大量繁殖使刺参生活在一个不健康的环境中，容易发生病害［11，18］。如果将微生态制剂直接施用到池塘底部，不仅可以在氨态氮浓度最高的地方将其利用掉，还能在菌株大量繁殖时抑制有害微生物的繁殖。固定后的高效降解菌株与传统的悬浮微生物处理法相比降解效率更高［23］，而且固定后的降解菌株不容易随着池塘换水而流失，也提高了菌株对环境(pH、温度、有毒物质等)的抗冲击能力［24］。

通过聚乙烯醇、海藻酸钠、交联树脂等多聚体化合物将具有降解功效的细菌包埋，其内部空间具有氧扩散能力，可以提高菌的降解功效和生长速度［24］。谢冰等［24］研究了海藻酸钠-氯化钙方法、聚乙烯醇硼酸法和聚乙烯醇冷冻-解冻法固定硝化细菌后的硝化速率发现，海藻酸钠-氯化钙方法固定的硝化细菌的硝化速率明显高于其他2种方法，而且海藻酸钠-氯化钙方法的制备过程操作简单。选择开发性能更加优良的固定化载体、反应器中最佳的细菌投加量、在实际应用中的稳定可靠性以及如何工厂化生产将是今后氨态氮降解菌株固定化的研究方向［25］。

4 氨氮降解菌株的应用现状

闫法军等［18］从刺参养殖池塘中分离筛选得到1株低温氨氮降解菌株，鉴定为马氏副球菌(Paracoccus marcusii)，该菌株在低温(15℃)、低接种量(＜5×10-3)条件下5 d后对富集培养基中氨态氮的降解率高达98%;经驯化后对1～20 g/L质量浓度的刺参饵料液中氨态氮3 d时间的去除率达91.7%～99.9%。陆锦天和李住［26］研究了生物净水剂对南美白对虾苗种池亚硝酸盐含量的影响，向池中施用硝化细菌、芽胞杆菌等生物净水剂，池水中亚硝酸盐含量由1.0 mg/L下降至0.1 mg/L，且没有出现反弹。李卓佳等［27］采用以芽胞杆菌属菌株为主导的复合制剂，在养殖斑节对虾的池塘中进行了3个月的实验，结果表明，实验组与对照组相比，氨氮降低了5%以上，溶解氧增加了30%～100%，斑节对虾的产量分别提高了50.3%和87.9%。

虽然在水产养殖中已有很多使用微生物来降解水体氨氮、亚硝酸盐和调节水质的大量报道，但还存在很多问题需要解决:①菌种在人工培育若干代后会出现形态、生化甚至是降解特性的变化，大多生产企业没有很好地监控细菌变异的问题，导致生产的成品出现质量问题，有可能把致病菌引入养殖环境中。Wang等［28］曾报道在养殖草虾中发现一种新的细菌性白斑病(BWSS)，怀疑是因大量使用含有枯草芽胞杆菌的益生菌产品所致;②养殖过程中仍然在大量使用广谱杀菌消毒剂和抗生素，当降解菌株与这些药物交叉使用时，大部分的菌株也被杀死，而不能在养殖池塘中建立稳定、有益的微生物群，导致降解菌株收效甚微;③高效氨态氮降解菌株工厂化生产后，产品中活菌受温度、环境氧浓度、光照、湿度等因素影响，在储存过程中活菌浓度逐渐下降。而且，产品中菌的浓度和固定剂的特性有很大关系。因此，如何保证产品到达施用地后仍保持较高的活菌浓度和寻找更加合适的固定剂成为当前氨态氮降解菌株工厂化生产的主要难题;④由于微生物之间具有复杂的协同作用，如何将各种降解菌株合理搭配、优化组合制造出更加高效的复合菌制剂产品还需要深入研究以及广泛的实践检验［29］。

5 氨氮降解菌株的实际应用现状

在池塘养殖过程中，为刺参提供一个低氨态氮的水环境和有益微生物群落是刺参健康、快速生长的前提。传统方法去除养殖水体中的氨态氮和预防疾病的方法会破坏养殖池塘中的微生物生态平衡，因此，使用从池塘分离筛选具有降解氨态氮功效的益生菌来降低池塘水体氨态氮具有很大的潜力。欧美、日本等国均主张在水产养殖中采用微生物方法降解养殖水体中的氨态氮和预防病害的发生。随着社会的发展和对环保意识的提高，微生物必将替代传统药物成为降解养殖水体氨态氮和预防病害的优良产品，为水产养殖业朝着绿色健康方向发展提供有力的保障。

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