吴庆华，史惠蓉，鲁 宁，江 淼，赵振华，孔祥东

郑州大学第一附属医院产前诊断中心郑州450052

#通讯作者，男，1969年8月生，博士，副教授，研究方向:单基因遗传病的基因诊断，E-mail:kongxd@263.net

血友病B是X连锁隐性遗传性出血性疾病，发病机制为凝血因子Ⅸ(factorⅨ，F9)基因突变导致血浆F9因子含量减少或功能缺陷。F9基因位于Xq27.1-27.2［1］，其突变可以发生在F9基因的任何位置。F9基因编码产物包括454个氨基酸，是肝脏合成的维生素K依赖性凝血因子之一，在凝血途径中起着重要的作用。该疾病尚无满意的根治方案，目前临床上仍以外源性的F9因子替代为主要方法，给家庭和社会带来沉重的负担。对血友病患者家族行携带者筛查和产前诊断是避免该出生缺陷最有效的方法。该研究采用对F9基因进行PCR扩增并扩增后DNA直接测序的方法，对3个血友病B家系成员进行了基因诊断、携带者筛查和胎儿的产前诊断。

1 对象与方法

1.1 家系资料 3个血友病B家系(图1)来自于2010年5月至2011年5月郑州大学第一附属医院产前诊断中心遗传咨询门诊，均有家族史，先证者已经临床确诊为血友病B患者。

家系1已发现患者3例。先证者Ⅲ2，男，25岁，自2岁起，家人发现其皮肤破损处血流难以自止，遂检测凝血功能，并确诊为F9因子活性低下。先证者的表弟Ⅲ12、舅舅Ⅱ4也均检测出F9因子活性低。先证者妹Ⅲ3妊娠18周时，来郑州大学第一附属医院产前诊断中心要求行携带者筛查，并请求产前诊断。家系成员Ⅲ4、Ⅲ11有生育要求，要求行携带者筛查。

家系2先证者Ⅱ5，男，19岁，外院查F9因子活性低下，临床表现为外伤后出血不止和反复性关节血肿，先证者及其母亲Ⅰ2、姐姐Ⅱ2、Ⅱ3和Ⅱ4要求行基因诊断和携带者筛查。家系中的2位女性携带者于妊娠18周行产前诊断。

家系3家族中仅发现1名患者Ⅱ1，男，3岁，外院查F9因子活性低下，转诊至郑州大学第一附属医院产前诊断中心要求进一步检查，其母在孕10周时来该中心行产前诊断。

来自郑州大学第一附属医院产前诊断中心积累的健康无血缘关系个体的100个DNA样本作为正常对照。该研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准，所有基因诊断工作均取得患者及家属的同意并签署知情同意书。

1.2 标本收集 ①抽取3个家系中先证者及其父母、要求行携带者筛查的家族女性成员外周静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝。②行产前诊断的4个孕妇分别于妊娠18周和10周，在无菌操作下采用羊膜腔或绒毛穿刺术抽取胎儿组织。采用北京天根试剂公司生产的DNA试剂盒提取DNA，操作步骤按照试剂盒的说明书进行。

1.3 PCR扩增及DNA测序 PCR扩增F9共8个外显子及侧翼序列的DNA，所用引物参照参考文献［2］合成。反应体系:50μg/L的模板DNA 2μL，500μmol/L的dNTP 2μL，上、下游引物各1μL，10×buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶2 U，纯水16.5 μL，共25μL。反应条件:94℃预变性5 min，95℃变性30 s，58～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。用乙醇对PCR产物进行纯化后，采用ABIBigDye 3.1测序试剂盒，PCR反应后纯化，在ABI3130xl基因测序仪上对标记产物进行测序，用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对，寻找基因突变位点。

图1 3个血友病B家系图谱

1.4 突变验证 针对研究中发现的新突变，对100名健康无关男性个体行相应的外显子测序排除为多态性位点后被认为是新突变。

1.5 胎儿组织母体污染排除和胎儿性别鉴定 对进行产前诊断的羊水和绒毛标本采用美国Promega公司的PowerPlex®16 HSSystem试剂盒和GeneMapper v3.2软件以排除母体污染，同时确定胎儿性别。

2 结果

2.1 家系中患者和携带者直接测序分析结果 家系1中先证者Ⅲ2和家族内另一患者Ⅲ12检出10487G＞A突变，位于第4外显子，导致GGA发生错义突变为AGA，编码氨基酸由79位的甘氨酸变为精氨酸(G79R)。先证者Ⅲ2的母亲Ⅱ1和家族女性成员Ⅲ3和Ⅲ11携带10487G＞A杂合突变，Ⅲ4未检出突变，故Ⅲ3和Ⅲ11为血友病B携带者，Ⅲ4为非携带者(图2)。

图2 家系1中F9基因第4外显子10487G＞A突变A:正常女性个体，为GG纯合子;B:女性携带者为GA杂合突变;C:患者为AA纯合突变;D:胎儿为正常个体。

家系2中，先证者Ⅱ5的F9基因检测出17788DelG突变，该突变位于第5外显子，先证者母亲Ⅰ2存在相同位点杂合缺失突变。对该家系女性成员行携带者筛查示Ⅱ3、Ⅱ4存在杂合缺失突变，提示Ⅱ3、Ⅱ4为血友病B携带者，Ⅱ2无突变，为正常女性个体(图3)。

图3 家系2中F9基因第5外显子17788DelG突变A:正常女性个体;B:女性携带者为17788DelG杂合缺失突变; C:患者为17788DelG纯合缺失;D:胎儿为正常个体。

家系3中，先证者的F9基因第2内含子5’端剪切位点处检出IVS2+4A＞T(c.6493A＞T)突变，其母Ⅰ2在相同位点检出A/T的杂合突变，其父未检出突变(图4)。

2.2 新突变验证 为鉴别17788DelG为突变或多态，对100名健康无关个体行第5外显子测序，均未发现携带有该突变，排除了17788DelG为多态的可能性。

2.3 产前诊断结果 家系1和2中的3个胎儿均为男胎，未携带有同家系中先证者相同的基因突变，家系3为女性胎儿，携带有IVS2+4A＞T杂合突变，为血友病B致病基因携带者。

2.4 随访 4个行产前诊断的胎儿家庭经遗传咨询后选择继续妊娠，在胎儿出生后取外周血行凝血因子检测，确定4个新生儿血清 F9因子活性均正常。

图4 家系3中F9基因第2外显子IVS2+4A＞T(c.6493A＞T)突变A:正常女性个体;B:女性携带者为第2内含子5’端A/T杂合突变;C:患者为TT纯合突变;D:胎儿携带A/T杂合突变。

3 讨论

临床上最常见的血友病为血友病A和血友病B，其中，血友病B占15%～20%。男性患者表现为关节、肌肉和内脏自发性出血、血肿或者外伤后出血不止，女性携带者无症状或症状轻微。F9基因是惟一发现与血友病B发生相关的基因。由于F9基因较小，现多采用全基因测序的方法对F9基因突变进行研究，可以在99%以上的血友病B患者中检出突变。研究［3］发现错义突变是最常见的基因突变，约80%左右，其次为无义突变、剪切位点突变、小缺失或插入、启动子区突变。在一些血友病B家系中，还检测到了 F9基因的双突变和三位点突变发生［4］。

该研究通过DNA测序方法对F9基因的8个外显子及其侧翼序列直接测序，检测出了与3个家系中血友病B患者相关的F9基因突变位点。家系1中F9基因突变发生于第4外显子，F9基因10487位发生了G→A的点突变，导致79位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸，该突变在血友病B突变数据库中已有报道。外显子4编码F9的类表皮生长因子1 (EGF1)结构区，EGF1区中含有一钙离子结合位点［5］，对于EGF区和γ羧基谷氨酸(Gla)结构区间形成正确的分子构象具有重要的作用，EGF1区结构的完整性是F9具有完整生物学活性所必需的，该区的核苷酸突变可以直接影响F9的生物学活性。

家系2中，F9基因突变位于第5外显子，其编码类表皮生长因子2结构域(EGF2)，由于先证者F9基因17788位发生G碱基缺失突变，导致随后表达的氨基酸出现移码突变。查阅国内外文献和最新的数据库，未见有该突变报道。

家系3中的患者在第2内含子5’端第四位碱基处由正常的A突变为T，形成新的剪切位点，影响细胞内前体mRNA的剪切，导致翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，或生成短截的蛋白质产物，该突变在印度人群中已有报道［6］。

基因测序技术尚未普及之前，连锁分析是最常用于血友病家族女性携带者筛查、产前基因诊断的方法，但采用的F9基因外多态性位点的同源重组现象可能使连锁分析出现错误。现在直接突变分析已取代了连锁分析方法，较既往使用连锁分析诊断时间大大缩短，且能够确定基因突变的位置，结果直接、精确。在先证者基因诊断明确的前体下，该研究采用DNA测序技术对可疑携带者和女性携带者的胎儿进行了基因诊断，明确了家系1中Ⅲ3的胎儿未携带有G79R突变，家系2中女性携带者Ⅱ3和Ⅱ4的胎儿未携带同先证者相同的17788DelG突变，提示均为正常胎儿。家系3中的先证者母亲妊娠的女性胎儿携带有IVS2+4A＞T杂合突变。4个行产前诊断的新生儿出生后取外周血检测F9活性，确定均非血友病B患者，提示应用DNA直接测序是对血友病B家系行产前诊断的快速准确的方法。

［1］Yoshitake S，Schach BG，Foster DC，et al.Nucleotide sequence of the gene for human factorⅨ (antihemophilic factor B)［J］.Biochemistry，1985，24(14):3736

［2］Vidal F，Farssac E，Altisent C，et al.FactorⅨ gene sequencing by a simple and sensitive 15-hour procedure for haemophilia B diagnosis:identification of two novelmutations［J］.Br JHaematolol，2000，111(2):549

［3］Belvini D，Salviato R，Radossi P，et al.Molecular genotyping of the Italian cohortof patientswith hemophilia B［J］.Haematologica，2005，90(5):635

［4］ Ghosh K，Shetty S，Quadros L，et al.Double mutations causing haemophilia B:a double whammy!［J］.Br J Haematol，2009，145(3):433

［5］Handford PA，Mayhew M，Baron M，et al.Key residues involved in calcium-bindingmotifs in EGF-like domains［J］.Nature，1991，351(6322):164

［6］Jayandharan GR，Shaji RV，Baidya S，et al.Molecular characterization of factorⅨ gene mutations in 53 patients with haemophilia B in India［J］.Thromb Haemost，2005，94(4):883