赵玉玲，马晓光，李 辉，徐吉英，闫国蕊，石 洁

河南省疾病预防控制中心结核病预防控制所郑州450016

#通讯作者，女，1965年5月生，本科，主任医师，研究方向:结核、HIV双重感染，E-mail:xjy3115@sohu.com

结核病是引起人类感染性疾病和死亡的主要原因，采用遗传标志物对结核分枝杆菌进行基因分型的研究［1］结果证实应用不同的基因分型方法可以将结核分枝杆菌的流行确定为主要是由几种特殊的基因型家族引起的，而且不同的基因型家族具有独特的分子特征、地域分布差异和致病性等。该研究运用RD105缺失基因检测法及常用的结核分枝杆菌分型技术可变数目串联重复序列分析(variable number tandem repeats analysis，VNTR)［2-5］对河南省尉氏县2009至2011年间的257株临床分离的结核分枝杆菌菌株进行基因分型，并应用比例法进行药敏试验，以了解北京家族基因型在该地区的分布情况，VNTR基因型分布特征和流行情况以及不同基因型与耐药性之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 所有菌株均来自于河南省尉氏县结核病防治机构2009年6月至2011年6月“结核病传播模式研究”项目中的临床患者痰标本，用罗氏培养基常规分离培养结核分枝杆菌，获得阳性培养物。标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供，作为该次试验的对照菌株。

1.2 菌株DNA的制备 将收集到的痰标本经40 g/L NaOH前处理后接种于酸性L-J培养基，37℃孵育培养2～4周，至有菌落生长，取一菌环菌溶于500μL TE(pH 8.0)中，80℃30 min水浴灭活，在旋涡振荡器上振荡至块状菌落均匀溶于TE中，沸水煮沸10min，12 000 r/min离心2min，取上清备用(－20℃冷冻保存)。

1.3 7个结核分枝杆菌VNTR的基因位点分型

1.3.1 位点的选择 根据文献［6］的报道筛选7个VNTR基因位点(表1)。PCR Mix均由北京康为世纪公司合成生产。

表1 位点名称与引物序列

1.3.2 VNTR-PCR 采用20μL PCR反应体系: 19μL PCR Mix，被检DNA模板1μL。VNTR3820的PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃ 1.5 min，25个循环;72℃延伸7 min。Qub11b、Qub11a、Qub26、Qub18、Mtub21、MIRU26的PCR反应条件:94℃预变性1 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，25个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶恒电压(5 V/cm)电泳，用Quantity one分析软件分析各PCR扩增产物大小并计算出各菌株的重复次数。

1.4 北京家族基因型的鉴定 采用RD105缺失基因检测法［7］。引物序列设计参照文献［7］，每个PCR管中加入19μL PCR Mix，1μL DNA模板。扩增条件:94℃预变性5 min;94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25个循环;72℃延伸7 min。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，有786 bp大小产物出现鉴定为北京家族基因型。

1.5 耐药性鉴定 根据“结核病诊断细菌学检验规程”［8］进行菌种鉴定。采用比例法对317株菌进行异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)4种药的药敏试验，4种药物在罗氏培养基中的终质量浓度分别为0.2、40.0、2.0和4.0 mg/L，以耐药百分比＞1%为阳性。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0处理数据。应用BioNumberics 5.0软件对菌株进行7个VNTR基因位点鉴定结果的聚类分析，应用χ2检验比较北京家族基因型与非北京家族基因型菌株主要流行与非主要流行菌群耐药性的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 北京家族基因型的鉴定结果 257株结核分枝杆菌中有233株(90.7%)鉴定为北京家族基因型菌株，其余24株(9.3%)为非北京家族基因型结核分枝杆菌菌株。见图1。

图1 结核分枝杆菌北京家族基因型鉴定结果1～5，7～8，10～12:北京家族基因型;6，9:非北京家族基因型;M:Marker。

2.2 7个VNTR基因位点分型结果的聚类分析257株结核分枝杆菌共230个基因型，参考文献［4］的方法，分为4个基因群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ群)。其中Ⅰ群有8个基因型(3.1%);Ⅱ群有79个基因型(30.7%);Ⅲ群有152个基因型(59.1%);Ⅳ群有18个基因型(7.0%)。

2.3 257株结核分枝杆菌药物敏感性结果 257株结核分枝杆菌中，75.5%(194/257)的菌株表现为全敏感，而24.5%(63/257)的菌株表现为耐药;其中耐多药结核分枝杆菌菌株占8.9%(23/257)。在北京家族基因型中，23.2%(54/233)的菌株为耐药株;而非北京家族基因型中，37.5%(9/24)的菌株为耐药株(χ2=2.412，P=0.120)。在主要流行Ⅲ群中27.6%(42/152)的菌株表现为耐药，而其他非主要流行群(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ群)中20.0%(21/105)的菌株表现为耐药(χ2=1.954，P=0.162)。

3 讨论

尉氏县地处豫东平原，2009年6月至2011年6月从该县结核病防治机构收治的结核病患者中分离的257株结核分枝杆菌具有一定的代表性，可用于分析该地区的结核病流行菌株的情况。

随着分子生物学技术的飞速发展，DNA分型鉴定技术被广泛地应用于结核病的流行病学研究领域。该研究应用7个VNTR基因位点的分型方法，得到了明确的数字化分型结果，结核分枝杆菌基因分型为14/5/8/5/8/8/5的菌株在研究中有6株，可能是该地区的优势传播菌株。在3对成簇的菌株中，其中一对菌株的来源患者经流行病学调查发现有较为明确的接触史，且其一为复发的结核患者，提示可能为同一菌株的传播所致。对其余成簇的菌株可增加其余9位点VNTR分型，如果9位点仍然全部一致，则需要再进行进一步的分型鉴定。

北京家族基因型菌株分布于整个亚洲地区［9］，在中国北京地区最常见，曾造成多次暴发流行［2］。该研究鉴定为北京家族基因型233株，占全部257株菌株的90.7%。这一比例高于2006年全国的平均水平(64.9%)［10］。可能因该研究中的入选样本量不是太大。

该研究鉴定出的耐多药结核分枝杆菌占8.9%，这一比例低于2000年全国平均水平(10.7%)［4］，与2007年全国结核病调查的耐多药率8.3%［10］基本一致。该研究北京家族基因型与非北京家族基因型菌株、主要流行(Ⅳ)群与非主要流行(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ)群菌株中耐药株的分布差异无统计学意义，提示基因型的分型与耐药间无明显关联。

［1］柳正卫，吕冰，王晓萌，等.71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究［J］.中国预防医学杂志，2008，9(12):1017

［2］Van Soolingen D，Qian L，de Haas PE，et al.Predominance of a single genotype ofMycobacterium tuberculosis in countries ofeast Asia［J］.JClin Microbiol，1995，33(12):3234

［3］全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告［J］.中国防痨杂志，2002，24(2):65

［4］许卫国，虞浩，杨丹丹，等.数目可变串联重复序列用于江苏省168株结核分枝杆菌菌株的基因分型研究［J］.南京医科大学学报:自然科学版，2007，27(12):1509

［5］Cowan LS，Mosher L，Diem L，et al.Varial-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units［J］.J Clin Microbiol，2002，40 (5):1592

［6］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，etal.Deciphering the biology of Mycobacterium.Tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393(6685):537

［7］吴长东，米利古，龚天美，等.RD105缺失基因检测法用于结核分枝杆菌新疆“北京家族”临床分离株的鉴定［J］.中国病原生物学杂志，2010，5(3):161

［8］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.北京:中国教育文化出版社，2006:46

［9］Glynn JR，Whiteley J，Bifani PJ，et al.Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculsis:a systematic review［J］.2002，8(8):843

［10］European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis.Beijing/W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance［J］.Emerg Infect Dis，2006，12(5):736