古艳婷，赵婷婷，李 平，张浩军，朱 斌，韩文兵，董 晞，费 敏，孙斯凡

（1.北京协和医学院，北京 100021；2.卫生部中日友好医院临床医学研究所，北京 100029）

糖尿病肾病的发病机制复杂，至今仍未完全阐明。许多研究认为糖尿病肾病时存在着自噬活性的下调，自噬途径受到抑制可导致细胞内受损的细胞器或蛋白大量积聚，足细胞完整性受到破坏、肾小管上皮细胞损伤及肾肥大等病理进程，参与了DN的发生发展［1］，而自噬激活对肾损伤有保护作用并可维持足细胞完整性。课题组在前期差异蛋白质组学中发现，二氢生物喋呤还原酶（dihydropteridine reductase，QDPR）在自发性II型糖尿病模型OLETF大鼠肾脏损害时的氨基酸发生突变，但该基因产物是否参与糖尿病肾病的发生发展还未有报道。本研究构建了野生型和突变型的QDPR重组质粒初步探讨了二氢生物喋呤还原酶对自噬作用的影响，以期为深入研究其在糖尿病肾病发病机制中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK 293T细胞、绿色荧光蛋白（GFP）为中日友好医院临床医学研究所药物药理室保存；真核表达载体pcDNA3.1/V5-His（美国Invitrogen公司）；新型pUM-T快速克隆试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）、大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；高保真PCR扩增试剂盒（德国Roche公司），T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR V、Pst I、Xba I（美国NewEngland Biolabs公司）；限制性内切酶Xba I、逆转录试剂盒（加拿大Fermentas公司）；凝胶回收纯化试剂盒、质粒中提试剂盒（德国QIAGEN公司）；DNA Maker DM5000（北京康为世纪生物技术有限公司）；鼠单抗V5抗体（美国Invitrogen公司）；兔多抗LC3（美国Sigma公司），兔多抗Beclin1抗体（美国Sigma-Aldrich公司），山羊抗小鼠IgG抗体（美国Abcam公司）；……