郝友华，李安意，丁红晖，朱 帆，赵西平，杨东亮

（1.华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室，武汉 430030； 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验研究中心，武汉 430030）

鸭乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）属嗜肝DNA病毒科，禽嗜肝DNA病毒属，其病毒颗粒为球型，有囊膜，直径40～50 nm。DHBV主要经卵垂直传播，雏鸭自然感染率高，感染后无明显临床症状。DHBV与人乙型肝肝炎病毒很类似，因而鸭乙型肝炎病毒及及其感染模型是在当前研究嗜肝DNA病毒复制机制和筛选抗乙型肝炎病毒药物中扮演重要作用［1-2］。建立雏鸭感染DHBV模型的影响因素较多，本研究主要比较了不同种雏鸭DHBV自然感染率和人工感染率，以及不同人工感染DHBV方法对病毒感染率的影响，观察了DHBV感染后鸭体内病毒载量稳定性，并对不同DHBV感染模型应用抗病毒药物抗病毒效果进行了比较分析，对进一步完善鸭乙肝病毒感染模型及其实际应用有着重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

2日龄樱桃谷鸭雏鸭80只，购自武汉市春江禽业有限责任公司；2日龄湖北麻鸭雏鸭分两批次：分别为146只，产地湖北天门；130只，产地湖北汉川。人工接种DHBV病毒株，拷贝数为2.0×107copies/mL，由本研究室制备保存。Real-time PCR试剂盒为SYBR® Premix Ex TaqTM（大连宝生物工程有限公司）。

1.2.1 鸭DHBV先天感染筛查

2日龄雏鸭下肢内侧，消毒后用一次性针头刺破表皮，取血50μL；置离心管中，37℃放置30 m in，12000 rpm×10 m in离心；分离血清，取血清煮沸10 m in，12000 rpm×10 min离心，取其上清做PCR模板，鉴定是否有DHBV自然感染。

1.2.2 鸭DHBV人工感染

未自然感染DHBV的雏鸭，分别经静脉注射和腹腔注射人种接种DHBV病毒株，每只200μL，接种后第10天，采血，PCR方法鉴定DHBV感染。

1.2.3 DHBV-DNA的PCR定性检测和定量PCR检测

根据DHBV序列分别设计2对引物，定性PCR引物序列为：S1：5＇-TGG CCT AAT CGG ATT ACT GG-3＇，S2：5＇-CAG CGT GGC TAA TTG AGT TA-3；定量PCR引物序列为：P1：5＇-GATACTGGAGCC CAAACC-3＇，P2：5＇-GGCAGAGGAGGAAGTCAT-3＇，由上海invitrogen公司合成；由上海英骏公司合成。定性PCR扩增条件分别为：94℃50 s、61℃45 s、72℃50 s、30个循环；定量PCR扩增条件：94℃5 s、58℃5 s、72℃15 s、40个循环。

1.2.4 在DHBV感染的鸭模型中观察拉米呋啶抗病毒实验

实验共分为4组，每组10只鸭，分别为（1）人工感染麻鸭组，此组给予安慰剂处理：三蒸超纯水，每只1 m L/kg，一天一次；（2）DHBV自然感染麻鸭组，人工感染樱桃谷鸭组、人工感染麻鸭组，此3组口服给拉米夫定：每只100 mg/kg，一天一次，给药15 d。实验各组在用药前（D0），用药第5天（D5），用药第10天（D10），用药第15天（D15）和停药后第5天（D20），采血，定量PCR检测DHBV-DNA载量变化。

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1.2.5 统计方法

数据采用SPSS软件（13.0版本）进行统计分析，以P＜0.01为有显著性差异。

2 结果

2.1 DHBV在不同鸭种中自然感染率比较

分别采集樱桃谷鸭、湖北麻鸭的血清，以处理后的血清为模板，应用定性PCR方法扩增DHBV片段，PCR产物大小为422 bp即为阳性。经检测在80只樱桃谷鸭血清中，DHBV阳性有7只，阳性率为8.75％；146只湖北天门麻鸭（湖北麻鸭-1），DHBV阳性有26只，阳性率为17.80％，131只湖北汉川麻鸭（湖北麻鸭-2），DHBV阳性有14只，阳性率为10.68％（图1）。统计分析显示：湖北麻鸭-1的自然感染率明显高于其它2组（P＜0.01）。

2.2 不同人工接种方法致雏鸭DHBV感染率比较

静脉注射和腹腔注射是DHBV人工感染雏鸭的两种常用方法。分别取20只未感染DHBV湖北麻鸭雏鸭，用同一DHBV阳性毒株，经鸭腿胫静脉注射和腹腔注射病毒；并与10只未感染DHBV的湖北麻鸭雏鸭一起饲养，10 d后采集鸭血清，定性PCR方法检测DHBV阳性率，结果显示：20只雏鸭静脉注射组，有16只出现阳性，阳性率为80％，20只雏鸭腹腔注射组13只阳性，阳性率为65％，未感染组没有出现DHBV阳性个体鸭（图2）。

图1 鸭乙肝病毒在雏鸭中的自然感染率（＊＊有统计学差异）Fig.1 Natural infection rate of duck hepatitis B virus in ducklings（＊＊Statistical significance）

图3 不同鸭种人工接种后DHBV感染率Fig.3 Infection rates in the different duckspecies by artificial inoculation

图2 不同人工接种方法致雏鸭DHBV感染率Fig.2 Infection rates in ducklings caused bydifferent artificial inoculation methods

2.3 不同鸭种人工接种DHBV感染率比较

分别取未感染DHBV的樱桃谷鸭和湖北麻鸭雏鸭各70只，用同一DHBV病毒株，经腹腔注射途径人工感染两种鸭雏鸭，10 d后采集鸭血清，PCR方法检测DHBV感染状况。结果显示：有48只樱桃谷鸭DHBV阳性，阳性率68.57％；有44只湖北麻鸭DHBV阳性，阳性率为62.85％。二者间无明显差异（P＞0.05）（图3）。

2.4 DHBV感染后鸭体内病毒血症变化

为观察DHBV感染后鸭体内病毒DNA载量的变化，分别对DHBV自然感染阳性湖北麻鸭、人工感染DHBV阳性的樱桃谷鸭和湖北麻鸭3组，各10只，从13日鸭龄开始，每间隔7 d，采集鸭血清，定量PCR检测病毒DNA的载量，连续观察28 d。结果见图4。3类DHBV感染鸭体内病毒载量维持在106～108copies/m L，3组间DNA载量变化无明显差异（P＞0.05）。

2.5 在DHBV感染鸭模型中拉米呋啶抗病毒效果

根据实验分组，分别给予安慰剂和拉米呋啶抗病毒药物处理，每组使用的动物分别为：处理组-1为樱桃谷鸭人工感染、处理组-2为湖北麻鸭人工感染、处理组-3为湖北麻鸭自然感染、安慰剂组为麻鸭人工感染。在用药前（D0），用药第5天（D5），用药第10天（D10），用药第15天（D15）和停药后第5天（D20），采血，定量PCR检测DHBV-DNA载量变化。结果见图5：给药后第10，15天后，除安慰剂组外，其余3组鸭血清DHBV-DNA显著降低，经统计学分析，病毒下降有显著的统计意义（P＜0.05）；停药5 d后，鸭体内DHBV-DNA滴度都出现了明显的反弹；3组间病毒变化趋势一致；但给予安慰剂组，鸭体内DHBV病毒没出现明显下降和反弹。

图4 DHBV感染后鸭体内病毒DNA载量的变化Fig.4 Changes of in vivo viral DNA load in DHBV-infected ducks

图5 抗病毒药物在不同鸭模型中抗病毒效果Fig.5 Antiviral effects of the drug in different duck models

3 讨论

鸭乙肝病毒在不同种雏鸭中自然感染率存在明显差异［3］。本研究应用PCR方法，比较了湖北麻鸭和樱桃谷对DHBV感染率，结果显示：湖北地区孵化的樱桃谷鸭DHBV自然感染为8.75％，湖北麻鸭DHBV自然感染率约为10％～20％；湖北麻鸭自然感染DHBV的比率明显高于樱桃谷鸭，与瞿涤等前期研究结果类似［4］。但即使是同为湖北麻鸭种，因来源不同其自然感染率也不同，这提示除了鸭的种类差异影响DHBV的自然感染率外，人工孵育鸭的不同方式也可能是影响其自然感染率不容忽视的重要因素。

雏鸭人工感染DHBV是制备鸭乙肝病毒感染模型的重要措施，其主要受人工感染的途径和雏鸭种类的影响［5］。人工感染的途径比较多，但以鸭腿胫静脉注射和腹腔注射途径感染最为常用。本研究比较了这两种途径感染DHBV的感染率。结果显示：这两种途径均能使雏鸭感染DHBV，但静脉注射途径感染率明显高于腹腔注射。而鸭种对人工感染率的影响不明显，本研究中不同种雏鸭人工感染DHBV后的感染率分别是：樱桃谷鸭为68.57％，湖北麻鸭为62.85％，二者间无明显差异。这提示鸭的种类不是影响DHBV实验感染雏鸭是否易感的主要因素。此外，本实验中将未自然感染DHBV的雏鸭与人工感染DHBV的雏鸭一起饲养，10 d后，这些鸭体内DHBV仍为阴性，提示DHBV传播主要以垂直传播途径为主，水平传播途径对病毒的传播影响较小。

DHBV感染鸭后，鸭体内病毒血症的稳定性和持续时间是成功建立鸭人工感染DHBV实验模型重要参数［6］。本研究比较了人工DHBV感染鸭和自然感染后，鸭体内的病毒血症和持续时间，结果显示：鸭体内病毒血症在不同途径感染中都能稳定持续存在；但自然感染的鸭中，不同个体病毒DNA载量波动较大；在病毒持续时间上无明显差异。此外，本研究还比较了抗病毒药物在不同DHBV感染模型中抗病毒效果，结果显示：人工感染组和自然感染组抗病毒效果的变化趋势具有较好的一致性，而且鸭种的差异对其也无明显影响。但樱桃谷鸭个体较大，实验中用药量等耗量也较大，这在该模型的实际应用中应考虑。

总之，鸭的种类，繁殖方式及人工感染途径均影响着DHBV感染率，虽然DHBV感染雏鸭后，鸭体内均可有持续性的病毒血症；但在建立鸭乙肝病毒感染模型中，为保证不同组别间病毒血的基线特征一致性、实验结果的稳定性和可比较性，应尽量选择未有DHBV感染的1～3日龄雏鸭进行人工感染建立模型，而且最好选用同一来源、同一批次的毒株作为感染源。

［1］Schultz U，Grgacic E，Nassal M.Duck hepatitis B virus：an invaluablemodel system for HBV infection［J］.Adv Virus Res.2004；63：1-70.

［2］胡静，姚云清。鸭乙型肝炎病毒模型的研究意义［J］。检验医学与临床，2007；4（4）：284-285.

［3］Omata M l.DHBV and liver diseases.Gastroenterol.1983；85 （2）：260.

［4］瞿涤，闻玉梅，林飞卿，等。七个鸭种携带鸭乙型肝炎病毒的研究［J］。中华传染病杂志，1985；4（3）：133-135.

［5］胡权，杨东亮。鸭乙型肝炎病毒感染模型的研究进展［J］。实用肝脏病杂志，2007；10（3）：201-204.

［6］谈博，张丰学，操红缨，等。鸭乙型肝炎病毒感染模型及其方法学研究进展［J］。热带医学杂志，2005；5（1）：111-113.