刘志良，石磊芝，杜亚明*

(1辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000;2浙江医院)

食管癌是人类六大常见的恶性肿瘤之一，也是危害我国的主要恶性肿瘤之一，主要以食管癌鳞癌为主。治疗主要是以手术为主的综合治疗，虽然我们手术对淋巴结清扫力度加大，但是5年生存率仍然不高。为了寻找更合理有效的治疗方法，我们需要对食管癌做进一步的研究。近几年，肿瘤干细胞(CSCs)学说认为CSCs是肿瘤的生长、转移、耐药等的根源［1］。HIWI基因是重要的干细胞标记物之一，在食管癌组织中已经发现其表达，表达水平与肿瘤的侵润深度、组织学分级及预后有密切的关系［2］。2011年6月～2012年1月，本研究旨在应用RNA干扰(RNAi)技术降低食管癌细胞系中HIWI的表达，观察其对细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞:食管癌细胞系Eca-109购自上海中科院细胞库。主要试剂:山羊抗人HIWI多克隆抗体(Santa Cruz公司);二抗:免疫荧光所用兔抗山羊IgG-TRITC TRITC-goat Anti-Mouse IgG，购自武汉博士德公司;胎牛血清(天津灏洋公司)，RPMI 1640培养基、胰酶(Gibco公司)。HIWI siRNA由上海吉玛公司合成，正义链:5'-GUGGGCCUUAUAUCAGUAUTT-3';反义链:5'-AUACUGAUAUAAGGCCCACTT-3'。HIWI上游引物:5'-AGAGGTTACCAGA CCAGAATGG-3'，下游引物:5'-GTGTGGGAGAAACACTACCACTT-3'，77 bp;GADPH上游引物:5'-CCACCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3'，下游引物: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'，597 bp。引物、RT-PCR试剂盒(Takara公司);siRNA转染培养基、LipofectamineTM2000及TRIzol均购自Invitrogen公司;琼脂糖(西班牙Biowest)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 食管癌细胞系Eca-109培养于RPMI 1640培养基中(调整浓度:1.5 g/L碳酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖、1.0 mmol/L丙酮酸钠、10 mmol/L HEPES)，培养基含有10%胎牛血清，不含抗生素，细胞于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养;细胞生长至80%融合时进行传代。

1.2.2 细胞免疫荧光 用胰酶消化细胞后吹打均匀，每孔约4 000个细胞接种在24孔板上，5%CO2孵箱培养过夜;4%多聚甲醛固定10 min;Triton X-100作用15 min;5%BSA室温封闭1 h;一抗湿盒4℃孵育过夜;二抗室温避光孵育2 h;Herst室温避光复染15 min。……