杨 春，陈 文，钟晓琳，王忠琼，陈 枫，夏纪毅

(泸州医学院附属医院，四川泸州64600)

HCV感染是全球流行疾病，与原发性肝癌(HCC)关系密切［1］。丙型肝炎非结构蛋白 4B (HCV-NS4B)是HCV的一个非结构蛋白，其功能到目前为止仍旧还不是很清楚［2］。相关研究显示NS4B蛋白在HCV感染细胞的恶性变中起重要作用［3］。我们前期研究证实HCV-NS4B促进肝细胞增殖［4］，还发现HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝细胞的表达［5］，提示HCV-NS4B在丙型肝炎致癌机制中可能起一定作用。而关于HCVNS4B蛋白对肝癌细胞增殖的影响及其机制的研究国内外未有报道。2010年2月～2011年3月，本研究采用HCV-NS4B表达载体，利用脂质体转染技术将NS4B导入肝癌细胞，检测其对肝癌细胞周期的影响，以及其对增殖细胞核抗原(PCNA)和周期素D1(cyclinD1)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2由泸州医学院附属医院中心实验室提供，PCXN2-NS4B质粒为李昌平教授构建并保存。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒转染及鉴定 HepG2细胞分为3组:空白对照组(未转染的 HepG2细胞)，空白载体组(PCXN2转染组)，PCXN2-NS4B转染组，每组设3个复孔。对数生长期细胞转染前1 d以2×105/mL接种于6孔板，37℃，5%CO2培养;待细胞生长达60%～80%汇合，加入以1.5 μg/4 μg配制质粒/脂质体混合物(DOSPER脂质体细胞转染试剂盒购自德国Roche公司)，空白对照组加入等体积无血清培养基。24 h后加入800 mg/mL G418(购自上海Sangon公司)筛选，待空白对照组细胞全部死亡后，G418减量为200 mg/L维持筛选并传代培养。

采用TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)一步法提取HepG2细胞总RNA。使用NS4B特异性的反向引物进行逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板，加入GoTaq DNA多聚酶、NS4B特异性的引物进行PCR反应。引物:正……