尹红英 王红兵

基因的突变、缺失是抑癌基因失活的主要途径，近年来研究表明启动子区域CpG岛的甲基化是导致抑癌基因失活的又一重要途径[1]。乳腺癌易感基因 ( breast cancer susceptibility gene,BRCA1)是参与多种肿瘤发生的抑癌基因[2]，研究表明其参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节、细胞凋亡和泛素化等重要的细胞活动[3]。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术，检测耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的状态，以探讨A549/Taxol细胞对紫杉醇的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

细胞基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司；BRCA1基因甲基化检测试剂盒为GENMED公司产品；PCR试剂盒为 Promega公司产品；引物由上海生物工程技术有限公司合成；耐紫杉醇人肺腺癌 A549细胞株(A549/Taxol)购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 A549/Taxol细胞培养 取A549/Taxol细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃含5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 甲基化特异性PCR(MSP) 取对数期生长的A549/Taxol细胞，参照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，在UV 3 000紫外分光光度仪上测定吸光度值鉴定DNA纯度，OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间。取2 μg基因组DNA，参照BRCA1基因甲基化检测试剂盒说明书进行甲基化修饰。分别取修饰DNA及未修饰DNA 100 ng进行MSP反应。BRCA1基因甲基化引物：M，F：5′- TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3′，R：5′- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3′。非甲基化引物：U,F：5′- TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3′，R：5′-CAAAAAATCTCAACAAAC-TCACACCA-3′。反应体系按照PCR试剂盒推荐量25 μl体系进行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板1 μl，无核酶水9.5 μl。MSP循环条件：95 ℃预变性12 min，95 ℃变性40 s，甲基化引物60℃退火45 s，非甲基化引物在57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循环扩增35次，72℃ 10 min。应用Gene Amp PCR System 2400扩增仪(美国PE公司)。甲基化特异性引物(M)扩增的目的片段为75 bp，非甲基化特异性引物(U)扩增的目的片段为86 bp。……