王 建 任常山

近年来研究发现，作为端粒酶的催化亚基—端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)不仅具有合成端粒的功能，还具有促进细胞增殖的作用，而这种作用不依赖于细胞端粒的维持和延长[1]。在前期研究中，观察到在HeLa细胞中沉默hTERT基因表达可引起表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)的表达下调[2]。鉴于恶性肿瘤的细胞增殖也与EGFR关系密切，本研究将进一步探讨靶向hTERT的RNA干扰抑制HeLa细胞增殖是否依赖于EGFR的作用，为靶向hTERT的抗癌治疗提供更充分的理论支持和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HeLa细胞(北京中科院肿瘤研究所)；siRNA-hTERT序列(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)；pcDNA3.1-EGFR真核表达载体(大连宝生物工程有限公司构建)；转染试剂Lipofectamine 2 000(Invitrogen公司)；兔抗人hTERT多克隆抗体、兔抗人EGFR多克隆抗体和鼠抗人α-Tubulin单克隆抗体 (Santa Cruz公司)；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(北京中杉试剂公司)；其余均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃ 、5%CO2、95%相对饱和湿度下的细胞培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组 A组：未处理组；B组：转染试剂组；C组：转染空载体组；D组：转染阴性siRNA组；E组：转染siRNA-hTERT组；F组：同时转染pcDNA3.1-EGFR和siRNA-hTERT组。

1.2.3 细胞转染 用于Western blot检测的细胞于6孔板中培养，用于MTT检测的细胞置于96孔板中培养。转染前调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于6孔板(96孔板)，每孔2 ml(100 μl)，达40%～50%汇合时转染。转染过程按照试剂盒说明书进行操作：DNA转染用量为4.0 μg/孔(0.2 μg/孔)，转染试剂10 μl/孔(0.5 μl/孔)；RNA转染用量为100 pmol/孔(5.0 pmol/孔)，转染试剂5.0 μl/孔(0.25 μl/孔)。

1.2.4 Western blot检测蛋白水平 转染48 h后裂解细胞提取细胞蛋白。……