叶 静 李明华 龙 霞 万汇涓 范 昭

乳腺癌MCF-7细胞是1种乳腺癌经典的细胞系，在很多乳腺癌研究中都采用此细胞系。该细胞具备分化的乳腺上皮细胞一些特性，比如雌二醇合成，可以表达雌激素和孕激素受体。Stratifin(又称14-3-3σ)和CyclinD2均为与细胞周期调节有关的基因，甲基化的发生可以影响其转录表达。Dnmt3b基因是1种DNA甲基化酶，与甲基化发生有关。本研究通过对它们甲基化和转录表达检测，一方面可以了解MCF-7细胞的表观遗传学特性，另一方面探讨基因甲基化发生的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

乳腺癌MCF-7细胞株为本实验室保存。2例乳腺浸润性导管癌组织为我院甲状腺乳腺外科手术切除的乳腺癌标本，经病理组织学检查证实，作为PCR扩增的对照标本。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7细胞复苏后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2条件下培养，换液培养，传代，待细胞稳定后收集细胞待用。

1.2.2 MSP(methylation specific PCR)检测Stratifin和CyclinD2基因的甲基化水平 收集细胞，抽提基因组DNA，按照Qiagen公司DNA Mini Kit试剂盒说明书进行操作，紫外分光光度仪检测含量和纯度。取DNA1.0 μg，按照Chemicon公司的CpGenomeTMDNA Modification Kit 试剂盒说明书步骤进行甲基化修饰。修饰后的DNA取2 μl，用Fermentas公司的PyroStar TM Fast PCR反应试剂盒进行PCR扩增：PyroStar TM Fast PCR Master Mix(2×)10 μl，上下游引物各1.0μl(10 pmol/μl)，ddH2O 6 μl，总体积20 μl。扩增条件为95℃ 1 min、95℃ 1 s、55℃/58℃ 5 s、72℃ 30 s，循环40个周期,最后72℃延伸10 min，引物序列见表1。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 RT-PCR检测Stratifin、CyclinD2和Dnmt3b基因的mRNA表达 收集乳腺癌细胞，用Trizol提取RNA，分光光度仪检测含量和纯度。取总RNA 1 μg，按照反转录试剂盒(Invitrogen)说明书进行cDNA链合成。取cDNA 1.0 μl，按照PCR反应试剂盒(Takara)说明书进行PCR扩增：2×PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各0.8 μl(10 pmol/μl)，加水至25 μl。……