周 婷 刘铁夫

近年来研究发现，低剂量的As2O3对急性早幼粒细胞白血病及包括肝癌在内的实体肿瘤细胞有促凋亡作用。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是细胞周期特异性药物，主要作用于S期细胞，其作用机制是抑制肿瘤细胞DNA合成，临床应用较广泛。本研究通过探讨As2O3、5-Fu联合治疗及序贯治疗对肝癌细胞BEL-7402的细胞毒作用及细胞凋亡情况，为寻找有效的临床化疗方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

BEL-7402肝癌细胞(东北师范大学遗传与细胞研究所朱筱娟教授馈赠)，CoCl2(美国Sigma公司)，5-Fu及As2O3(购自本院)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞BEL-7402置于10%胎牛血清及1%双抗DMEM培养液中培养。加入培养液的化学缺氧剂CoCl2终浓度为150 μmol/L[1]，用于模拟肿瘤细胞内缺氧微环境。

1.2.2 药物处理 实验分3组，取对数生长期的BEL-7402肝癌细胞，对照组加入100 mg/L 5-Fu培养48 h；联合用药组在100 mg/L 5-Fu+0.5μmol/L As2O3作用下培养48 h；序贯用药组在0.5 μmol/L As2O3作用下培养24 h后，再用100 mg/L 5-Fu培养24 h，三组分别作用48 h后收集细胞用于实验。

1.2.3 MTT法检测 MTT法测定缺氧条件下As2O3、5-Fu联合治疗及序贯治疗对肝癌细胞BEL-7402的细胞毒效应：三组在作用48 h时取出培养板，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后，每孔加入150 μl二甲基亚砜，酶标仪波长490 nm处测吸光度(A)值。按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%

1.2.4 流式细胞仪检测分析细胞周期和细胞凋亡率 分别收集3组细胞1×106个，4℃PBS洗后重悬，离心，加入Annexin V-FITC(20 μg/mL)和PI(50 μg/mL)后避光室温反应30 min，加入300 μl结合缓冲液后在流式细胞仪上检测细胞周期和细胞凋亡率。

1.3统计学方法

2 结果

2.1 细胞毒作用

与单用5-Fu及序贯用药组相比，联合用药组毒性明显增强,与单用5-Fu相比序贯用药组毒性明显增强，见表1。……