杨 欣，刘 杰，刘 瑛，吴永林，范凤鸣，刘 辉，张鹏艳，李玉华

(成都生物制品研究所有限责任公司，四川 成都 610023)

流行型感冒(流感)是一种常见的急性呼吸道传染病，由甲、乙、丙三型流感病毒引起，接种流感疫苗是预防流感的有效手段。鸡胚尿囊腔接种是常用的流感病毒培养方法，它具有病毒产量高，操作简便，经济实用等优点。然而鸡胚尿囊病毒液常含有鸡胚中的杂蛋白，其中卵清蛋白是引起疫苗使用者过敏的主要物质之一，所以鸡胚尿囊病毒液的纯化是制备流感疫苗的关键技术。目前纯化病毒的方法主要有超滤法、超速离心法和柱色谱法［1-3］。本文采用中空纤维柱超滤和分子筛色谱的方法纯化鸡胚流感病毒。

1 材料

750 kD中空纤维超滤系统(Quixstand Benchtop System，GE公司);K50/100柱、P-50泵、Uvis 920检测仪、REC 112记录仪(Phamacia公司)。

流感病毒毒种(H1N1 NYMC X-181 reassortant、H3N2 NYMC X-187 reassortant、B NYMC BX-35 reassortant)、标准抗原及标准抗血清均来自英国国家生物制品检定所(NIBSC);海蓝白种蛋购自北京蓝风养殖有限公司;卵清蛋白ELISA检测试剂盒，Seramun Diagnostica GmbH公司产品;预染蛋白标准，New England Biolabs(NEB)产品;兔抗甲流(H1N1)病毒HA单克隆抗体购自Sino Biological Inc.;羊抗兔IgG(AP标记)购自Sigma公司。

2 方法

2.1 单价流感病毒尿囊液的制备

从工作毒种库中取毒种1支，1∶10 000倍稀释，接种于10 d龄鸡胚尿囊腔，经33～35℃培养48～72 h后，筛选活胚置2～8℃冷胚24 h，收获病毒尿囊液，尿囊液血凝滴度应不低于1∶160，微生物限度检测符合《中国药典》要求［4］。尿囊液中加入甲醛至终浓度1:5 000，2～8℃放置7 d，灭活病毒。

2.2 超滤

将灭活的单价病毒尿囊液用5，3和1 μm滤器过滤后，再用750 kD中空纤维超滤系统超滤浓缩至50倍，缓冲液为pH 7.2，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。……