郭 冉，刘洁婷，吴 丹，刘海峰，初彦辉

(牡丹江医学院 1.生理教研室，2.黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011)

重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备

郭 冉1，刘洁婷2，吴 丹2，刘海峰2，初彦辉2

(牡丹江医学院 1.生理教研室，2.黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011)

目的 克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)基因，原核表达TGF-β1蛋白，制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法 应用RT-PCR技术扩增人TGF-β1基因序列，构建pET-28a-TGF-β1重组质粒。转化至E.coli BL21(DE3)中，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。Western-blot检测目的蛋白的抗原性。免疫新西兰白兔，获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体，间接ELISA法检测多克隆抗体效价，Westernblot技术进行抗体特异性检测。结果 获得了TGF-β1编码序列和表达载体，目的蛋白主要存在于超声破碎后的包涵体中;经Western-blot检测目的蛋白存在抗原性;获得纯化的兔抗人多克隆抗体效价达1∶10 000。结论 获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体效价较高，具有良好的特异性。

转化生长因子β1;抗纤维化;原核表达;多克隆抗体

转化生长因子β(TGF-β)对瘢痕成纤维细胞的生物学效应起到主要的调控作用并参与瘢痕形成中的调节活动，目前研究最为广泛［1-2］。TGF-β被认为是促进纤维化发展的最重要的生长因子［3］。在创伤中TGF-β1的表达增加，同时还能刺激成纤维细胞产生内源性TGF-β1，甚至加入外源性的 TGF-β1可以增加创伤中胶原纤维蛋白和炎性细胞的数量［4-5］。正反馈刺激作用 TGF-β1可加速体外培养的瘢痕疙瘩细胞增殖和分裂并促进胶原的基因表达和蛋白合成

陈永平等［7］曾提出将 TGF-β1构建为疫苗，刺激机体产生抗体，中和体内产生的过量的TGF-β1。相关文献报道，抗TGF-β1抗体具有中和TGF-β1活性的作用［8］，anti-TGF-β1抗体能明显抑制成纤维细胞的超微结构，能抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成［9］。

本实验通过原核表达TGF-β1蛋白，以该蛋白作为抗原，在动物体内制备多克隆抗血清，并检测该抗体的特异性，为进一步研究TGF-β1与纤维化的关系提供相应的实验基础。

1 材料

载体 pET-28a、E.coli DH5α、E.coli BL21 菌株由本实验室保存;引物序列递交上海生工生物工程技术有限公司合成;Trizol Reagent为Invitrogen公司产品;逆转录酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶及Pfu DNA聚合酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品;BCA蛋白定量试剂盒购于盖宁生物科技(北京)有限公司;UPS-蛋白质银染试剂盒由温州安得森生物科技有限公司惠赠;兔抗-TGFβ1抗体、HRP标记的羊抗兔IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。

雄性新西兰白兔3只购自黑龙江省中医药大学动物中心。

2 方法

2.1 TGF-β1 基因的构建

参照Gene bank数据库提供的人TGF-β1的cDNA序列设计引物，为方便克隆在上下游引物的5'端分别加入NdeⅠ和HindⅢ酶切位点。

引物序列:5'GATGGGAATTCCATATGGCCCTGGACACCAACTATTG3'

5'ACTGCCCAAGCTTGCTGCACTTGCAGGAGCG3'

采用Trizol Reagent试剂抽提人血中总RNA，RT-PCR 方法逆转录合成 cDNA［10］。

2.2 TGF-β1 表达载体的构建

PCR产物经1%琼脂糖凝胶分离，回收的基因与载体pET-28a质粒经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，用T4连接酶进行连接，得到pET-28a-TGF-β1重组质粒。重组质粒转化至 E.coli DH5α，对重组子进行酶切鉴定，阳性克隆进行测序。

2.3 TGF-β1 蛋白的表达

将测序正确的重组基因转化至E.coli BL21中，得到表达菌株 pET-28a-TGF-β1/BL21，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。离心收集菌体。菌体重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)30 mL中。冰浴下，超声破碎重悬菌。包涵体复性处理。取复性后透析后液体进行SDS-PAGE分析。应用常规方法测定复性后目的蛋白浓度［11］。Western blot检测蛋白抗原性。

2.4 多克隆抗体的制备

取复性后的蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分乳化，皮下多点注射新西兰白兔，每只用量为0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐剂加强免疫1次。共加强免疫3次，后两次加强免疫直接静脉注射不含佐剂的抗原0.5 mg。第21天开始耳缘静脉取血检测效价，末次免疫7 d后颈总动脉采血收集抗血清，分装后－80℃保存。

2.5 多克隆抗体的纯化

采用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化抗体［12］。①取兔血清10 mL与等体积生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加SAS(饱和硫酸铵溶液)20 mL，于4℃缓慢搅拌3～4 h，使蛋白充分沉淀;②4℃，3 000 r/min离心30 min，弃上清，用生理盐水6 mL溶解沉淀，缓慢滴加SAS 4 mL，4℃缓慢搅拌1 h;③重复②;④4℃离心，用生理盐水6.7 mL溶解沉淀，滴加SAS 3.3 mL，4℃缓慢搅拌1 h;⑤重复④;⑥4℃离心，用10 mmoL/L PBS(pH 7.4)2 mL 溶解沉淀，PBS透析，更换3次PBS，4℃缓慢摇动过夜，得到抗血清，分装后置－20℃保存备用。

2.6 检测多克隆抗体的效价

间接ELISA法检测纯化后多抗兔血清效价，10 mmoL/L PBS倍比稀释(1∶200 ～1∶25 600)多抗血清，同时取免疫前血清1∶500稀释，作为阴性对照。每组3个复孔。

2.7 SDS-PAGE、Western blot检测抗体

取纯化后的抗血清，进行SDS-PAGE检测，确定纯化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及纯化的效果。取未诱导的空菌及复性后的TGF-β1蛋白10 μL，以纯化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗体作为一抗(1∶10 000)，以HRP标记的羊抗兔酶标抗体作为二抗进行Western blot检测抗体的特异性。

3 结果

3.1 TGF-β1 基因构建

利用RT-PCR方法，以人外周血cDNA为模板，扩增TGF-β1基因。如图1所示，其PCR扩增产物大小约为360 bp，与实验设计一致。

3.2 TGF-β1 表达载体的构建

阳性克隆质粒用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切进行鉴定。结果如图2所示。获得的目的片段大小与实际相符。阳性克隆重组质粒递交中美泰和生物技术(北京)有限公司进行序列测定，测序结果表明插入序列和通读框均正确。

图1 TGF-β1基因片段的PCR扩增Fig.1 The PCR production of TGF-β1 gene fragment

图2 重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of pET-28a-TGF-β1 recombinant plasmid using double digests method

3.3 TGF-β1 蛋白的表达

经12%SDS-PAGE检测，目的蛋白主要存在于包涵体中。测定复性后目的蛋白浓度为3.5 mg/mL。SDS-PAGE检测结果如图3所示。约16 kD的位置上出现特异条带，符合目的蛋白理论推算值。

图3 SDS-PAGE分析TGF-β1表达Fig.3 SDS-PAGE analysis for the expression and purity of TGF-β1 protein

3.4 Western blot检测目的蛋白的抗原性

一抗为兔抗人TGF-β1多抗，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，结果如图4，经过比对确定，在约16 kD处显示单一条带，证实经纯化后的TGF-β1蛋白具有抗原性，可以应用于下一步抗体的制备。

图4 免疫印迹分析TGF-β1蛋白Fig.4 Western-blot analysis for the TGF-β1 protein

3.5 多克隆抗体效价测定

SAS盐析沉淀法纯化抗体，间接ELISA方法检测抗体效价，纯化后抗体效价达1∶12 800。纯化后的抗血清经还原型SDS-PAGE检测，结果如图5，主要蛋白条带在约50 kD位置，符合兔IgG基本特征，另外，在20 kD左右出现较弥散的条带，为IgG轻链分子。

图5 SDS-PAGE分析多克隆抗体Fig.5 SDS-PAGE analysis for polyclonal antibody

3.6 Western blot检测抗体

以纯化后的多克隆抗体作为一抗，与未诱导空菌及复性后的 TGF-β1蛋白进行Western blot免疫印迹分析，结果如图6所示。结果表明，多克隆抗血清与TGF-β1目的蛋白分子质量位置发生反应，说明制备的多克隆抗体能与目的蛋白特异性结合。

4 讨论

抗TGF-β1抗体，作为TGF-β1有效的拮抗剂，能竞争性抑制TGF-β1与其受体结合，阻断其生物活性，从而避免或者减轻TGF-β1对机体产生的不利影响，并对各种器官的纤维化治疗起到一定的作用。一些研究TGF-β与瘢痕形成的关系发现，应用抗TGF-β抗体可能会减轻瘢痕。

目前，对TGF-β抗体的研究多为体外实验，且TGF-β抗体成品比较昂贵，使其应用受到限制。本实验以原核表达获得的TGF-β1蛋白作为抗原，在动物体内制备多克隆抗血清。经饱和硫酸铵盐析法纯化后，间接 ELISA检测多克隆抗体效价达1∶10 000以上。SDS-PAGE 分析及 Western blot检测，本研究所获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体纯度较高，能与TGF-β1目的蛋白特异性结合。为进一步研究与TGF-β1密切相关的疾病，特别是抗纤维化的研究提供了有利条件，奠定了物质基础。

［1］Wynn T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.J Pathol，2008，214:199-210.

［2］Gorelik L，Flavell R A.Transforming growth factor-beta in T-cell biology［J］.Nat Rev Immunol，2002，2:46-53.

［3］Williams E J，Gaca M D，Brigstock DR，et al.Increased expression of connective tissue growth factor in fibrotic human liver and in activated hepatic stellate cells［J］.Hepatology，2000，32(5):754-761.

［4］Liu X，Hu H，Yin JQ.Therapeutic strategies against TGF-beta signaling pathway in hepatic fibrosis［J］.Liver Int，2006，26:8-22.

［5］Roberts A B，Russo A，Felici A，et al.Smad3:a key player in pathogenetic mechanisms dependent on TGF-beta［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，995:1-10.

［6］Massagjue J.TGF-beta signal transduction ［J］.Annu Revbiochem，1998，67:753.

［7］陈永平，潘陈为，王晓东，等，转化生长因子β1与乙型肝炎病毒核心抗原融合基因的表达和鉴定［J］.中华传染病杂志，2005，23:328-330.

［8］Shah M，Foreman D M，Ferguson M W.Control of scarring in adult wounds by neutralizing antibody to transforming growth factor beta［J］.Lancet，1992，339:213-214.

［9］李宜姝，郝立君，苏海涛.抗转化生长因子β1对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响［J］.黑龙江医学，2002，26(9):657-659.

［10］姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法［J］.北京:人民军医出版社，1996.

［11］金慧英，唐治华.葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化［J］.中国生化药物杂志，2009，30(1):38-40.

［12］龚环宇.人成熟型TGF-β基因克隆、表达及其多克隆抗体的制备与初步临床应用［D］.长沙:中南大学湘雅医院，2003.

Recombinant human TGF-β1 prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation

GUO Ran1，LIU Jie-ting2，WU Dan2，LIU Hai-feng2，CHU Yan-hui2
(Mudanjiang Medical University，1.Department of Physiology，Heilongjiang Key Laboratory of Anti-fibrosis Biotherapy，Mudanjiang 157011，China)

Purpose To clone human TGF-β1 gene and prokaryotic expression of TGF-β1 protein through the expression of this gene，and then to get the rabbit-anti-human TGF-β1 polyclonal antibody from the immune rabbit with this protein.Methods Using RT-PCR technique to amplified human TGF-β1 gene sequence.Then the target gene was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a by using the recombinant DNA technique.After induced by IPTG，the protein TGF-β1 was expressed in E.coli BL21(DE3).The protein testified its antigenicity by Western-blot.Next，we immunized New Zealand white rabbits with the obtained recombinant protein as antigen.We collected the immune sera of rabbit.Then purified antibody by ammonium sulfate fractionationthen，the indirect Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the polyclonal antibodies titer.Western-blot techniques were used to identify antibody specificity.Results The encoding sequence and expression vector of TGF-β1 was obtained while the interest protein was mainly expressed in the inclusion body.Western-blot detection of the target protein displays antigenicity.The purified rabbit anti-human polyclonal antibodies titer is 1∶10 000.Conclusion The rabbit anti-human TGF-β1 polyclonal antibodies titer is higher and has a better specificity.

TGF-β1;anti-fibrosis;prokaryotic expression;polyclonal antibody

Q78

A

1005-1678(2012)04-0354-04

2011-09-16

黑龙江省自然基金(D2007-99);黑龙江省高等教育学会高等教育科学研究“十一五”规划课题(开放省重点实验室对创新人才培养的改革与探索)

郭 冉，男，硕士，助教，E-mail:guoran1980@sina.com;初彦辉，男，通信作者，教授，硕士生导师，Tel:0453-6984634，E-mail:yanhui_chu@sina.com。