张小永，罗爱平，唐会周

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

牛肉预煮液作为培养基氮源的可能性探讨

张小永，罗爱平*，唐会周

（贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

牛肉预煮液进行离心、过滤等预处理后，将其浓缩至原体积的75%、50%，主要测定总氮、氨基酸态氮含量。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌为质控菌株，检验三种不同浓度牛肉预煮液替代普通肉汤的灵敏度，并观察三种质控菌株分别在不同浓度牛肉预煮液配制的营养琼脂上生长的菌落形态。结果表明：原液、浓缩至原体积75%、50%浓缩液总氮含量分别为2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸态氮含量分别为0.945、1.425、1.890mg/mL；磷酸盐实验、碱性沉淀实验、色素生成实验以及灵敏度均符合培养基要求。三种质控菌株的菌落形态、菌落大小、色素生成均符合菌株的生长特性，在50%的浓缩液牛肉预煮液配制的营养肉汤中培养24h，灵敏度均能达到10-9，敏感性最强，故可将总氮、氨基酸态氮含量分别达4.088、1.890mg/mL的浓缩液替代用于此三种质控菌株培养的牛肉浸液。

牛肉预煮液，总氮，培养基，牛肉浸液

预煮是牛肉深加工中重要的工艺环节之一［1］，预煮后所剩的汤汁即为牛肉预煮液。牛肉预煮液中含氮物质丰富，包括游离氨基酸、二肽、尿素、胍的衍生物、嘌呤碱等［2］，是一类可再利用的氮源。牛肉浸液是动物组织浸液中最古典的培养基成分，由切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉绞碎，煮制过滤而得［3］。它是培养基基础液，广泛用于配制营养肉汤、营养琼脂、半固体等培养基，主要为微生物生长繁殖提供可溶性含氮物、核酸降解物、维生素及无机盐等，以补充蛋白胨营养成分的不足。牛肉预煮液是牛肉制品生产过程中的副产物，在生产过程中作为废弃物排放，不仅导致污染环境，而且是一种资源的浪费。本实验拟探讨牛肉预煮液替代牛肉浸液作为微生物培养基有机氮源的可能性，旨在为牛肉预煮液的综合利用寻求一条途径，为现代生物技术及产业化发展的重要基础性材料寻求质优价廉的原材料。

表1 麦氏比浊管配制表

1 材料与方法

1.1 材料与设备

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌 贵州大学食品营养与安全系微生物实验室提供；牛肉预煮液 贵州永红食品有限公司提供，预煮的牛肉与水质量比（m/m）为1∶1；琼脂 杭州微生物试剂有限公司；牛肉膏 上海康润生物科技有限公司。

CD4-2低速离心机 北京医用离心机厂；凯氏定氮仪 上海昕瑞仪器仪表有限公司；LDZM-50立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；真空旋转蒸发仪 上海雅荣生化设备仪器有限公司；HI208台式pH测定仪 北京哈纳科仪科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛肉预煮液预处理

1.2.1.1 工艺流程 牛肉预煮液→粗滤→精滤→离心→浓缩

1.2.1.2 操作要点 粗滤：牛肉预煮液在10～15℃条件下静置，使脂肪凝固，便于过滤，用四层纱布过滤。精滤：取滤液进一步用滤纸过滤。离心：将精滤处理的牛肉预煮液3500r/min离心30min，滤液备用。浓缩：离心处理的牛肉预煮液在55℃，真空度0.02MPa条件下浓缩，浓缩至原体积的75%、50%，121℃、30min高压灭菌，置4℃下保存备用。原液、浓缩至原体积75%、50%浓缩液以下分别简称1、2、3号液。

1.2.1.3 麦氏比浊管的制作及使用 分别配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液，取口径相等质地相同的试管10支，按表1所示分别将硫酸及氯化钡溶液加入，封固管口，注明号码备用。

将0.9%（w/v）NaCl无菌生理盐水洗下的三种质控菌株分别加入与标准管大小相同的无菌试管中。被测定试管加入0.9%（w/v）NaCl无菌生理盐水，直至浓度与所要求的标准管浓度相同。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以稀释倍数即可得到每毫升中所含细菌的数量。如细菌原液1∶5稀释后其浊度与第3管相当，则原液每毫升含菌数为9×5=45亿。

菌液的稀释按下列公式计算：

如原液5mL，每毫升含菌45亿，今欲稀释为每毫升含菌10亿的溶液，应加无菌生理盐水的毫升数为：（5×45）/（10-5）=17.5mL，即细菌原液5mL加生理盐水17.5mL稀释即成。

1.2.2 牛肉预煮液理化指标测定

1.2.2.1 总氮含量测定 凯氏定氮法，按 GB/T 9695.11-2008。

1.2.2.2 氨基酸态氮测定 双指示剂甲醛滴定法，按GB/T 5009.39-2003。

1.2.2.3 还原糖测定 高锰酸钾滴定法，按 GB/T 5009.7-2008。

1.2.2.4 pH测定 HI208台式pH测定仪测定。

1.2.2.5 颜色、澄明度和沉淀 分别取1、2、3号液各50mL加热煮沸，冷却后直接观察溶液的颜色、澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.6 碱性沉淀 分别取1、2、3号液各100mL，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液调pH8～9，121℃、30min高压灭菌，冷却后直接观察澄明度和沉淀［3］。

1.2.2.7 磷酸盐沉淀 分别取1、2、3号液100mL、磷酸二氢钾0.5g，置于250mL三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液调pH7.4～7.6，121℃、30min高压灭菌，冷却后直接观察澄明度和沉淀［3］。

1.2.3 菌种活化 制备营养琼脂斜面培养基，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三种质控菌种逐代培养至第3代（F3），保存备用。

1.2.4 灵敏度测定［4-5］采用3次3管法，分别测定1、2、3号液替代营养肉汤的灵敏度。取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌第3代（F3）培养菌株，用0.9%（w/v）NaCl无菌生理盐水制成均匀菌液，此菌液浓度相当于麦氏比浊管第10管浓度。将此浓度菌液用生理盐水分别进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9五个稀释度分别接种1mL于三种浓度牛肉预煮液滤液9mL小管，各3管，同时各取3个试管不接种菌悬液作阴性对照。37℃培养3d，逐日观察结果。

1.2.5 色素生成测定 取三种质控菌菌悬液0.1mL，分别接种于1、2、3号液制成的三种营养琼脂平皿内，用L型玻棒涂匀，37℃培养24h。同时各取3个平皿不接种菌悬液作阴性对照。

营养琼脂配制：牛肉预煮液原液、浓缩至原体积75%、50%浓缩液各1000mL；氯化钠，5g；琼脂，15g；pH7.2～7.6。

1.2.6 菌落形态观察 同色素生成测定。

2 结果与分析

2.1 理化指标测定结果

1、2、3号液理化指标测定结果见表2。

表2 牛肉预煮液理化指标测定结果

表3 三种不同浓度牛肉预煮液替代营养肉汤的灵敏度

如表2所示，1、2、3号液，总氮含量分别为2.044、3.066、4.088mg/mL，氨基酸态氮含量分别为0.945、1.425、1.890mg/mL；均为澄清，微黄；沉淀、磷酸盐沉淀及碱性沉淀在实验中均无。据薛丽华等报道［4］，华安牛肉浸液中总氮含量为3.68mg/mL。结果表明：浓缩牛肉预煮液可达到普通牛肉浸液水平，可将浓缩至原体积50%即总氮含量达4.088mg/mL、氨基酸态氮含量达1.890mg/mL的牛肉预煮液作为传统牛肉浸液的替代品。

2.2 灵敏度

灵敏度是培养基质量的一项重要指标，是指一种培养基对某一种微生物在该培养基中能得以良好生长的最低接种量。如表3所示，1号液接种金黄色葡萄球菌，37℃培养24h后灵敏度达10-8，培养48h后灵敏度达10-9；接种大肠杆菌，37℃培养24h后灵敏度达10-8，但不及接种金黄色葡萄球菌敏感，3管检验管中仅有2管呈阳性，在培养48h后灵敏度达10-9；接种沙门氏菌，37℃培养24h后灵敏度达10-8，培养48h后灵敏度仍为10-8，培养72h后灵敏度达10-9。

2号液接种金黄色葡萄球菌，37℃培养24h后灵敏度10-9；接种大肠杆菌，37℃培养24h后灵敏度达10-8，培养48h后灵敏度达10-9，但不及接种金黄色葡萄球菌敏感，3管检验管中仅有2管呈阳性；接种沙门氏菌，37℃培养24h后灵敏度达10-9。

3号液接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌37℃培养24h后灵敏度均达到10-9，金黄色葡萄球菌最为敏感，3管检验管均呈阳性；大肠杆菌与沙门氏菌3管检验管中仅有2管呈阳性。

不同浓度牛肉预煮液的灵敏度实验表明，灵敏度随含氮量提高而增强，即1号＜2号＜3号。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌在3号液替代营养肉汤中生长情况均较好。金黄色葡萄球菌在3号液中形成较多悬浮菌；大肠杆菌在3号液中生长形成菌膜，中部生成悬浮菌；沙门氏菌在3号液表面生成菌膜，中部有悬浮菌。

2.3 色素生成实验与菌落形态观察

色素生成实验反映了某种菌在培养基中生长是否符合其本质特性。如表4所示，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌分别接种到1、2、3号液配制的三种营养琼脂培养基中，37℃培养24h后，菌落形态均呈S型；金黄色葡萄球菌菌落直径D为1.4～1.6mm，大肠杆菌菌落为2.0～2.3mm，沙门氏菌菌落为1.6～1.8mm。除金黄色葡萄球菌有金黄色色素生成外，其余2种菌株均无色素生成。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的生长情况，均符合该菌株的生长特性［6-7］。

表4 三种质控菌株的菌落形态和色素生成结果

综上所述，原液、浓缩至原体积75%、50%浓缩液的磷酸盐实验、碱性沉淀实验、色素生成实验和菌落观察，以及灵敏度结果均符合培养基要求［8-9］。

3 结论与讨论

3.1 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌是食品卫生检验中常规的检测指标，是保障食品质量安全的控制指标，故本实验选用此三种菌株探讨牛肉预煮液作为培养基氮源的可能性。

3.2 牛肉浸液是以牛肉为原料而制成，成本较高。牛肉预煮液在牛肉制品生产过程中作为废弃物排放，但经离心、过滤等简单处理即可变废为宝，作为微生物培养基氮源。结果表明：原液、浓缩至原体积75%、50%浓缩液的磷酸盐实验、碱性沉淀实验、色素生成实验和菌落观察，以及灵敏度结果均符合培养基要求。

3.3 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌在50%的浓缩液替代的营养肉汤中灵敏度达到10-9，敏感性最强；菌落形态、菌落大小、色素生成均符合菌株的生长特性。故可将经预处理的牛肉预煮液浓缩，使其总氮含量达4.088mg/mL、氨基酸态氮含量达1.890mg/mL，替代用于培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三种质控菌株的传统牛肉浸液，但能否作为其他微生物生长繁殖的氮源还有待进一步研究。

［1］周光宏.畜产品加工学［M］.北京：中国农业出版社，2002： 94.

［2］马美湖，葛长荣，罗欣.动物性食品加工学［M］.北京：中国轻工业出版社，2006：133-134.

［3］陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京：中国农业出版社，1995：84.

［4］薛丽华.牛肉浸出液配制培养基的比较［J］.中国兽药杂志，2003，37（12）：35-37.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典第三册［M］.北京：化学工业出版社，2005：附录73-74.

［6］Thompson D R.Response surface experimentation［J］.Food Proc Pres，1982（6）：155.

［7］汪穗福.微生物检测验证技术［M］.北京：中国医药科技出版社，2005：72-79.

［8］吴清平，孟凡亚，蔡芷荷，等.微生物培养基质量控制技术和标准［J］.微生物学报，2006，33（6）：128-129.

［9］马乐好，阚方琦.商品微生物培养基质量状况及其控制［J］.中国公共卫生，2007，23（12）：1535-1536.

Study on the possibility of pre-cooked beef fluid nitrogen as a medium to explore

ZHANG Xiao-yong，LUO Ai-ping*，TANG Hui-zhou
（College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Pre-cooked beef liquid to centrifugation and filtration etc，was concentrated to the original volume of its 75%，50%，mainly determination of total nitrogen，amino nitrogen content.Staphylococcus aureus，E.coli，Salmonella strains for quality control，testing of three different concentrations of pre-cooked beef broth liquid alternative to ordinary sensitivity，and to observe the three kinds of quality control strains were pre-cooked beef at different concentrations of nutrient agar solution prepared on the growth of colony morphology.The results showed that：the original pre-cooked beef liquid，concentrated to the original volume of 75%，50%concentrated liquid TN contents were 2.044，3.066，4.088mg/mL，amino acid nitrogen contents were 0.945，1.425，1.890mg/mL.Phosphate test，alkaline precipitation test，pigment-producing testing and sensitivity met the media requirements.Three kinds of quality control strains of colony morphology，colony size，pigment-producing strains were in line with the growth characteristics.Concentrated solution in 50%of the pre-cooked beef liquid nutrient broth prepared to cultivate 24h sensitivity can reach 10-9，the sensitivity of the strongest.Therefore TN，amino nitrogen content were up to 4.088，1.890mg/mL can be alternative to the concentrated solution of three quality control strains used for this culture of beef extract.

pre-cooked beef fluid；total nitrogen；culture media；beef immersion

TS251.9

A

1002-0306（2011）01-0172-04

2010-02-01 *通讯联系人

张小永（1982-），在读硕士，研究方向：药食资源利用。