姚 虹,吕 治,苏建荣

(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心,北京100050)

有资料表明,在细菌性阴道炎的微生物菌群中阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis,GV)处于优势地位,数量明显高于其他非正常菌群[1]。目前对GV的实验室诊断随着分子生物学技术的发展,PCR技术以快速,敏感和特异等优点迅速地应用到临床。PCR检测细菌的关键之一是模板的选择,即要确定扩增的目的基因。因此,简单实用的细菌基因组DNA的提取是GV研究的基础。本研究通过多种方法提取GV基因组DNA,然后通过定量检测进行比较,建立一种简单高效的细菌基因组DNA提取的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 GV株为卫生部质控株。

1.1.2 试剂 蛋白酶K,溶菌酶,SDS均是Sigma公司生产。

1.1.3 仪器 凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Doc 2000型,PCR仪为Biotronic公司AG-9600型,荧光定量PCR扩增仪为ABI7300。CO2培养箱为日本SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 将菌株接种于人血琼脂平板上,5%CO2,35℃培养24小时。挑取单个菌落接种于脑心浸出液液体培养基,CO2培养箱培养至2.0麦氏比浊单位。

1.2.2 细菌基因组DNA提取方法 ①酚-氯仿抽提法 1ml细菌过夜培养液,5 000 rpm离心10min,去上清液,加550μl TE悬浮沉淀,并加50μl 10%SDS,50μl 20 mg/ml蛋白酶 K,混匀,37℃保温1 h。加 150μl 5mmol/L NaCl,混匀。加150μl CTAB/Na-Cl溶液,混匀,65℃保温20 min。用等体积酚:氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提 ,5 000 rpm离心 10 min,将上清液移至干净离心管中,用等体积酚∶氯仿(24∶1)抽提,取上清液移至干净试管中,加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟,沉淀DNA,用70%乙醇漂洗沉淀后,洗干,溶解于100μl TE,-20℃保存[2]。②加热煮沸法 取1 ml细菌过夜培养液,5 000 rpm离心10 min,去上清液,加100μl TE,100℃煮沸10 min,高速低温离心10 min(4℃,12 000 r/min),取上清液-20℃保存[2]。

③溶菌酶-煮沸法 取1 ml细……