董训江，钟 婵，蔡秋凤，曹敏杰

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

董训江，钟 婵，蔡秋凤，曹敏杰*

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

通过硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤和Hydroxyapatite羟基磷灰石层析，从杂色鲍(Haliotis diversicolor)内脏中分离纯化了组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示，纯化蛋白的分子量约为28ku。该酶最适温度37℃，最适pH5.5。当温度低于40℃，pH在5.0～6.5范围内该酶较稳定。底物特异性实验与抑制剂实验结果表明，该酶属于半胱氨酸蛋白酶。金属离子Mn2+、Ba2+和Mg2+对该酶有不同程度的激活作用，而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等对该酶起抑制作用。

杂色鲍，组织蛋白酶L，分离纯化，性质研究

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杂色鲍 购自福建省厦门市大嶝岛养殖场，平均体重(28.0±2.0)g，新鲜的杂色鲍即杀取其内脏，立即使用或冻存于-80℃待用;SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 瑞典 Amersham Biosciences公司;羟基磷灰石预装柱(CHT-ⅡCartridge) Bio-Rad公司;荧光底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Arg-MCA等 日本Peptide Institute公司;反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮(E-64) Amresco公司;Chymostatin、Leupeptin Roche公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Benzamidine Sigma公司;标准蛋白 Fermentas公司;其它试剂 均为国产分析纯。

Avanti JA-25大型高速冷冻离心机 美国Beckman公司;BioPhotometer紫外分光光度计 德国Eppendorf公司;FP-6200荧光分光光度计 日本Jasco公司;G∶BOX凝胶成像仪装置 美国Syngene公司;组织捣碎机 瑞士Kinematica公司;WB-14恒温水浴锅 德国Memmert公司;蛋白质电泳装置美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶活力的测定 以Z-Phe-Arg-MCA为底物，参照Barrett［9］等人的方法，并略作修改：50μL酶液加入900μL含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的0.1mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)(缓冲液A)中，混合均匀后加入50μL 10μmol/L荧光底物，在37℃反应10min，立即加入1.5mL终止液(甲醇∶异……