周华生，张连龙，戴舒春，成恒嵩

(无锡健特药业有限公司，江苏无锡 214091)

钼蓝比色法测定保健食品中微量硒

周华生，张连龙，戴舒春，成恒嵩

(无锡健特药业有限公司，江苏无锡 214091)

建立了钼蓝比色法测定保健食品中微量硒的新方法。该方法最大吸收波长760nm，在0～100ng/mL浓度范围内浓度与吸光度呈线性关系，回归方程y=－4.142+133.2x，相关系数r=0.9991，最低检测量1ng/mL，重复性好，RSD=3.17%，回收率95.98%～105.00%。该方法简便、快速、灵敏、准确，适合不同补硒类保健食品中的硒含量测定，该方法的建立有利于这类产品质量控制和提高。

保健食品，钼蓝比色法，硒，测定

硒是人体必需的微量元素之一，它在人体内具有清除活性氧自由基、抗肿瘤、抗辐射、防治心脑血管疾病和增强机体免疫能力等功能［1］。由于硒在人体内适宜浓度范围较窄，每天摄入量的多寡，对人体健康影响较大，过少达不到补硒的应有作用，过多会引起慢性中毒［2］。1976年国际硒营养学会推荐每天摄入标准为60μg，1988年中国营养学会推荐日采摄标准为50μg。目前国家规定药用亚硒酸钠原料中硒含量测定采用硫代硫酸钠滴定法［3］，食品中硒含量则用氢化物原子荧光光谱法和荧光法测定［4］，这些都是经典的方法。但药物的化学滴定法仅用于纯品原料，不适合保健食品中硒的测定。食品中硒的2种测定方法则需要昂贵的仪器，操作步骤繁琐，尤其是荧光 法 要 使 用 2，3－二 氨 基 萘 (2，3－Diaminonaphthalene，DAN)，荧光试剂毒性较大，而钼蓝比色法简便、快捷、灵敏、准确，适合保健食品中微量硒的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

儿童及青少年型多种维生素咀嚼片、女士型和中老年型多种维生素片、灵硒康口服液 本公司生产;富硒康口服液 华信生物药业股份有限公司;富硒胶囊 天狮生物工程有限公司;善存佳维片 惠氏制药有限公司;酵母硒胶囊 安琪酵母股份有限公司;益美胶囊 娃哈哈集团有限公司;奥硒康胶囊 天赐福生物医药有限公司，市场收集购买;硝酸、高氯酸、盐酸、硫酸 优级纯;次磷酸钠、磷钼酸、氯化汞、乙二胺四乙酸二钠、三乙醇胺、酒石酸钾钠、氢氧化钠、氨水 分析纯;水 去离子水;硒标准溶液 100μg/m L，中国计量科学研究院提供，精密吸取该溶液0.50m L，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至100m L，此溶液为0.5μg/m L硒标准使用液。

UV－2450型紫外可见分光光度计、AA－6800型原子荧光分光光度计 日本岛津;F－4500型荧光分光光度计 日本日立;AE－240型分析天平Mettler;pHs－3型精密数显酸度计 上海天达仪器有限公司;HH－S2S型数显恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线绘制 精密吸取0.5μg/m L硒标准使用液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00m L 分别置于 25m L 容量瓶中，相当于 0、10、20、40、60、80、100ng/m L 硒，各加1∶1 盐酸溶液5m L，50μg/m L 氯化汞溶液2.5m L，1%次磷酸钠溶液2.5m L，0.01mol/L的磷钼酸溶液2.5m L，1∶1磷酸溶液0.5m L，用水定容至刻度，摇匀，将容量瓶置55℃恒温水浴锅25m in后取出，此时溶液呈蓝绿色，冷却至室温，在可见光谱600～900nm连续扫描，确定测定波长。

表1 显色体系的稳定性

1.2.2 反应条件 在预实验基础上，标准品浓度60ng/m L 条件下，反应温度为 51、53、55、57、59℃;反应时间为21、23、25、29、31m in;反应酸度，其中1∶1 的盐酸溶液为 1、3、5、7、9m L，1% 次磷酸钠溶液为 1、1.5、2.5、3.5、4.5m L，0.01mol/L 的磷钼酸溶液为 1、1.5、2.5、3.5、4.5m L，1∶1 磷酸溶液为 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9m L，做各个反应条件的单因素实验，测定显色液的吸光度。

1.2.3 样品消化 固体样品:用研钵碾成细粉，视样品含硒量高低精确称取约0.5g;液体样品:摇匀精密吸取约2m L，于消化管内加混合酸(硝酸∶高氯酸=3∶1)12m L，放在消化炉上加热，保持微沸，持续加热至冒白烟，冷却后无色透明，此时加入10m L 1∶9盐酸溶液，继续加热至剩余体积约2m L，切忌烧干，冷却后用水转移至50m L容量瓶中，定容，摇匀待用，同时做空白实验。

1.2.4 样品测定 精密吸取消化液10m L，于25m L容量瓶中按标准曲线同样操作，显色，测定吸光度。

式中，C－由回归方程求出样品中硒含量，ng;V1－样品消化液吸取量，m L;V2－样品消化液总体积，m L;m－样品的质量，g或m L。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长

标准品和样品按测定方法显色，在可见光谱600～900nm连续扫描。由图1可见，标准品和样品最大吸收峰为760nm。

图1 标准品和样品的光谱图

2.2 反应温度、时间和酸度的最佳条件

实验结果表明，在一定的标准品浓度条件下，随着温度的升高，吸光度增大，高于57℃后，吸光度有所降低，故选择55℃为最佳反应温度。同样选择反应时间25m in，1∶1的盐酸溶液用量5m L，1%次磷酸钠溶液用量2.5m L，0.01mol/L的磷钼酸溶液用量2.5m L，1∶1 磷酸溶液用量 0.5m L。

2.3 线性范围、回归方程、相关系数和最低检测限

当标准品硒浓度为0、10、20、40、60、80、100ng/m L时，对应的吸光度分别为 0.00、0.064、0.105、0.184、0.335、0.489、0.624，在 0～100ng/m L 浓度范围内呈直线回归，回归方程y=－4.142+133.2x，相关系数r=0.9991，最低检测限按GB/T5009.1－2003的方法确定为1ng/m L。

2.4 方法稳定性

标准品和处理后的样品按测定方法显色，放置一定时间后测定，显色液在2h内吸光度保持不变，稳定性较好。结果见表1。

2.5 主要共存离子的影响与消除

实验中发现某些含多种维生素和矿物质的保健食品，消化后有机部分被消除，而无机的矿物质被留在消化液中。在所测的保健食品中，涉及的无机离子有 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Cr3+、Fe2+等，其测定时最高含量分别为Ca2+1mg/m L、Mg2+0.5mg/m L、Zn2+20μg/m L、Cu2+5μg/m L、Mn2+10μg/m L、Cr3+100ng/m L，再加入标准Se4+80ng/m L，吸光度分别为0.482、0.487、0.478、0.491、0.479、0.492，与未加上述离子时标准品测定结果一致，说明对测定结果均无影响，而Fe2+影响较大，当Fe2+≤0.2μg/m L对测定结果无影响，随着浓度增高，颜色逐渐变浅，吸光度降低，当Fe2+≥10μg/m L时则不显色(表2)。表2为在80ng/m L标准品浓度下，加不同浓度Fe2+后的测定结果。

为了消除Fe2+的干扰，实验选用多种掩蔽剂，取得明显效果的有以下几种:a.样品消化后转移过程中，加入2m L 2mol/L EDTANa2，用 1∶1 氨水调 pH1.5～2.0，定容后测定。b.样品消化后转移过程中，加入10m L 20%酒石酸钾钠，用4mol/L氢氧化钠调至黄色沉淀，定容静置后吸取上清液测定。c.样品消化转移过程中，加入2m L 1∶1三乙醇胺定容后测定。

实验证明，加入上述3种掩蔽剂的任何1种都可以消除Fe2+干扰，进行钼蓝比色法测定(表3)，这是因为这些掩蔽剂与Fe2+形成络合物，抑制了Fe2+活度［5］，使钼蓝显色正常进行。

表3 掩蔽剂的效果

表2 Fe2+干扰的测定

表4 精密度测定

表6 不同保健食品硒含量测定

2.6 精密度测定

实验选用中老年型维生素保健食品，精确称取6份样品按测定方法消化，加入掩蔽剂显色后测定吸光度，计算硒含量，结果见表4。由表4可知，实验重复性较好，RSD=3.17%，精密度较高。

2.7 回收率测定

试液选用灵硒康保健食品，按测定方法消化、制备3种不同浓度的样品本底，分别加入3种不同浓度标准品，每种浓度重复3次，共9个样本分别测定回收率，结果见表5。在线性范围内，“低”、“中”、“高”浓度样品的回收率均很好，回收率为95.98%～105.00%，符合定量测定要求。

2.8 不同保健食品硒含量测定

不同类型补硒类保健食品分别用钼蓝法及食品中硒含量测定2种国标法进行验证，结果均相吻合，结果见表6。其中钼蓝法与荧光法接近程度优于氢化原子荧光法，钼蓝法与荧光法相对误差为3.14%～4.79%，而与氢化原子荧光法相对误差为2.39%～11.54%。这说明钼蓝法和荧光法比原子荧光法相对稳定，而且钼蓝法仪器简单，即普通的分光光度计就可以测定，其灵敏度高，检测限低，操作便捷，符合保健食品中硒测定要求。

表5 回收率测定

3 讨论

3.1 钼蓝比色法是在酸性介质中，还原剂将磷钼杂多酸还原为钼蓝，其颜色深浅与硒含量成正比。本研究以盐酸为介质，次磷酸钠为还原剂，Se4+为催化剂，催化次磷酸钠的还原性，氯化汞为显色稳定剂。要完成此反应，必须使 Se6+转化为Se4+，反应式如下:Se6++HCl→Se4+，H3PO4+H3Mo12O40P·2H2O(磷钼酸)→PMo12O40(磷钼杂多酸)，PMo12O40+NaH2PO2·H2O(次磷酸钠)+Se4+→H3PO410MoO3(钼蓝)。但多种维生素片和善存佳维片添加大量的Fe2+阻止了Se4+的催化作用，只有加掩蔽剂，抑制Fe2+的活度，才生成钼蓝。而对未加入Fe2+的保健食品，如灵硒康、富硒康、酵母硒胶囊等，则无需加入掩蔽剂，便可直接进行测定。

3.2 国内外用比色法测定微量硒(ng级)的方法较多，如酸性铬蓝K催化褪色法测定人发、茶叶和肉类产品中的硒［6］，碘化钾－结晶紫法测定井水中的硒［7］，碘化钾－孔雀石绿测定矿泉水、自来水中的硒［8］，以及醋酸氨基乙烯亚铁铵催化分光光度法测定天然水中的硒［9］，这些方法由于空白值本底较高，标准品浓度梯度吸光度差异不明显，线性范围较窄，灵敏度低，测定对象成分较单一，尝试后均不适合成分复杂的保健食品硒的测定。

3.3 钼蓝比色法只需要严格控制反应温度、时间、酸度等条件，其线性范围宽、灵敏度高、检测限低，为1ng/m L，而荧光法为0.5ng/mL，氢化原子荧光法为3ng/m L，可与国标的2种方法相媲美。但是钼蓝比色法简单、快速、廉价，适合于多种补硒类保健食品中微量硒的测定，值得广泛运用和推广。

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Colorimetric determination of trace amounts of selenium with molybdenum blue in health foods

ZHOU Hua－sheng，ZHANG Lian－long，DAI Shu－chun，CHENG Heng－song

(Wuxi Gaint Pharmaceutical CO.，LTD.，Wuxi214091，China)

The novelmethod was described for the colorimetric determination of micro－quantities of selenium with molybdenum blue in health food.The maximum absorbance wavelength was 760nm，the linearity range was 0～100ng/m L，regression equation was y= －4.142+133.2x，r=0.9991.The detection limit，repeatability(RSD)and recovery were 1ng/m L，3.17%and 95.98%～105.00%respectively.The method was simple，rap id，sensitive，accurate，and was suitable to assay selenium in varied riching－selenium health food.This established analytical method provided a useful way in quality control and improvement in this type of food.

health food;molybdenum blue spec trophotometry;selenium;determination

TS207.5+1

A

1002－0306(2011)08－0412－04

2010－05－10

周华生(1977－)，男，主管药师，从事药品和保健食品质量检测和分析方法的研究。