胡银川，李明元，谢 晖，邱一雯

(西华大学生物工程学院，四川成都 610039)

塑料桶装食用油中邻苯二甲酸酯固相萃取方法研究

胡银川，李明元*，谢 晖，邱一雯

(西华大学生物工程学院，四川成都 610039)

为了准确检测塑料桶装食用油中邻苯二甲酸酯污染程度，利用响应面法对食用油中的邻苯二甲酸酯的固相萃取条件进行优化。探讨了不同洗脱剂、洗脱体积、洗脱速率、弗罗里硅土与样品比例对邻苯二甲酸酯固相萃取的影响。在单因素的基础上，对洗脱剂、洗脱体积、洗脱速率3个因素进行Box－Behnken设计，以食用油中邻苯二甲酸酯萃取量为响应值，通过响应面分析法对固相萃取条件进行优化。经实验确定的最佳萃取条件为:丙酮正己烷浓度42%，洗脱体积49mL，洗脱速率8r/min;在5、10、15mg/kg的添加水平，邻苯二甲酸酯的加标回收率在94.67%～101.83%之间，相对标准偏差在1.78%～2.77%之间。响应面法优化后的邻苯二甲酸酯回收率有较大的提高。

固相萃取，邻苯二甲酸酯，食用油，GC－MS，响应曲面法

邻苯二甲酸酯类(PAEs)是塑料工业中普遍使用的一类化学物质，主要用作增塑剂和软化剂，其作用是增大塑料的可塑性和韧性，提高塑料的强度［1］。PAEs在塑料中为游离状态，极易迁移到食品中［2］。PAEs是脂溶性物质，一旦进入人体，便很快积蓄在脂肪组织里，富集在人体内，不易排泄出去［3－4］。研究表明，PAEs的急毒性作用虽不明显，但可引起肝、肾、肺及心脏、生殖等多组织系统的中毒，其中以雄性生殖系统损害最为明显［5－6］。塑料桶装食用油在使用过程中，PAEs会从塑料中溶出、并迁移到食用油中。食用油基质复杂、干扰众多，PAEs含量少，采用恰当的前处理减少干扰，是分析检测食用油中PAEs含量的关键。固相萃取(SPE)是一种发展最快的样品净化前处理技术，其原理简单，操作简便，省时。样品首先通过活化过的固相小柱，固相吸附剂将目标化合物保留在柱上，然后用少量的有机溶剂洗脱下来。响应面设计能迅速、可靠、简易地对影响萃取过程中的因子水平及其交互作用进行优化与评价。本实验利用Design－Expert 7.1.3软件对食用油中PAEs固相萃取条件进行优化，为检测食用油中PAEs含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

塑料桶装食用油 存放两年;正己烷、丙酮、无水硫酸钠 分析纯，成都科龙试剂化工厂;乙腈 色谱纯，成都科龙试剂化工厂;弗罗里硅土、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二－(2－乙基己基)酯(DEHP) 上海安谱科学仪器有限公司;超纯水。

表1 PAEs的线性范围、相关系数、线性方程及检出限

马弗炉 深圳中达电炉厂;电子天平 上海精科天平有限公司;层析柱 上海华美实验仪器厂;恒流泵 上海青浦沪西仪器厂;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;氮气吹扫仪 上海天呈科技有限公司;0.45μm微孔滤头 天津津腾实验设备有限公司;气相色谱－质谱联用仪 日本岛津公司 GCMSQP2010，NIST05.LIB标准库。

1.2 实验方法

1.2.1 萃取工艺 在200×10mm的玻璃层析柱内放入少许脱脂棉，从下到上依次分别加入0.5g无水硫酸钠、3.5g经灼烧和活化后的弗罗里硅土和0.5g无水硫酸钠，敲击层析柱使其装填均匀，再放入少许脱脂棉。加10m L含5%(V/V)丙酮正己烷溶液淋洗吸附剂，去除吸附剂中的极性杂质;然后用30m L正己烷淋洗以备用于样品处理。

称取食用油样品2g，移入25m L容量瓶中后用正己烷溶解定容至25m L，然后将溶液通过自制的弗罗里硅土固相萃取柱富集，弃去流出液;用49m L的42%(V/V)丙酮正己烷混合溶液以8 r/m in洗脱吸附在柱上的PAEs，收集洗脱液于50m L圆底烧瓶中，于55℃旋转蒸发浓缩至5m L，然后用氮气流吹干，再用乙腈溶解并定容至2m L，混匀，0.45μm微孔滤膜过滤，供 GC－MS 分析［7］。

1.2.2 色谱和质谱条件 色谱柱:DB－5TH弹性石英毛细管柱(15m×0.25mm×0.10μm);载气为高纯度氦气，载气流速1m L/m in;进样口温度:250℃;柱温条件为初始温度150℃，保持1min，以60℃/min升温至240℃，保持1m in，以40℃/min升温至260℃，保持5m in。进样量1μL;分流进样，分流比50∶1。

电子轰击(EI)离子源;电离能量70eV;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;接口温度280℃;全扫描(SCAN)与离子监测方式(SIM)采集模式，全扫描范围:40～400m/z，DBP和DEHP的定量离子均为149。

1.2.3 标准曲线的制作 取DBP和DEHP的混合标准系列溶液(1.0、2.0、5.0、10.0、50.0mg/L)，按照上述色谱和质谱条件进行分析，外标法定量。每次进样 1μL，平行测定 3次，以峰面积 y对浓度x(mg/L)进行线性回归，得到回归方程和相关系数，见表1。

1.2.4 单因素实验 在其它条件相同的情况下，分别考察不同的洗脱剂、洗脱速率、洗脱体积、弗罗里硅土与食用油比例对食用油中PAEs固相萃取的影响。

1.2.5 响应面实验设计 通过单因素实验确定影响食用油中PAEs固相萃取的关键因素，以食用油中PAEs萃取量为响应值，采用响应面法对关键因素进行中心组合设计实验，从而确定优化条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 洗脱剂对PAEs萃取的影响 在洗脱速率24 r/min，洗脱体积20m L，弗罗里硅土与食用油比例为3.5∶2条件下，根据与正己烷的互溶性、PAEs在正相固定相的极性强弱选择丙酮正己烷浓度(体积比)分别为 10%、20%、30%、40%、50%作洗脱剂对PAEs固相萃取。

图1 洗脱剂对PAEs萃取的影响

由图1可知，本实验考察了不同浓度的丙酮正己烷混合洗脱剂对PAEs的洗脱效果影响。实验表明，10%、20%、30%的丙酮正己烷混合溶液不能将萃取柱上的PAEs完全洗脱下来，而40%的丙酮正己烷混合溶液可以完全将目标物洗脱出。

2.1.2 洗脱体积对PAEs萃取的影响 以40%的丙酮正己烷混合溶液为洗脱剂，在洗脱速率24r/min，弗罗里硅土与食用油比例为3.5∶2下，考察洗脱剂体积对PAEs固相萃取的影响。

图2 洗脱体积对PAEs萃取的影响

洗脱体积是影响固相萃取的一个重要因素，洗脱体积太小，不能把目标物质完全洗脱下来;洗脱体积太大，不仅浪费洗脱试剂，而且可能将更多的干扰物质洗脱出，对目标物检测带来干扰。由图2可知，当洗脱体积为40m L时，已可将目标物完全洗脱出来，当超过40m L时，随着洗脱体积增加，PAEs含量略有降低。

2.1.3 洗脱速率对PAEs萃取的影响 以40%的丙酮正己烷混合溶液为洗脱剂，在洗脱体积40m L，弗罗里硅土与食用油比例为3.5∶2下，考察洗脱速率对PAEs固相萃取的影响。

洗脱速率太快，洗脱剂不能与目标物质完全作用，难以把目标物完全洗脱下来;洗脱速率太慢，增加了目标物与环境的接触时间，并且洗脱剂不能顺利地将PAEs从小柱中带出。由图3可知，当洗脱速率为6 r/m in时，PAEs含量最大，当超过6 r/m in时，随着洗脱速率的增加，PAEs含量降低。

表4 模型可信度分析

图3 洗脱速率对PAEs萃取的影响

图4 弗罗里硅土与食用油比例对PAEs萃取的影响

2.2 响应面分析及结果

根据Box－behnken中心组合设计原理，选取相关性密切的丙酮正己烷浓度、洗脱速率、洗脱体积3因素，按表2的因子编码及水平进行食用油中PAEs固相萃取条件的响应面模型优化，实验设计及结果见表3，模型可信度分析见表4。

表2 Box－Behnken设计实验因素水平及编码值

利用Design－Expert 7.1.3软件对表3的实验结果进行多元回归拟合，获得DBP含量(Y1)、DEHP含量(Y2)对丙酮正己烷浓度(X1)、洗脱速率(X2)、洗脱体积(X3)的二次多项回归模型方程为:

表3 Box－Behnken实验设计及结果

由表4可知，DBP和DEHP模型P值均小于0.0001，表明两模型是极显著的，回归方程描述因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系显著，即这种实验方法是可靠的;两模型失拟项P值分别为0.1007和0.1549，失拟项均不显著，表明所建模型拟合性好，实验误差小;DBP和DEHP回归模型的复相关系数R2分别为0.9962、0.9977，校正系数分别为0.9913、0.9949，其值越接近1，说明此模型越能预测其响应值。信噪比分别为38.529和60.411，均大于4，是合意的，表明有很强的信号。Y的变异系数CV表示实验的精确度，CV值越低表示实验可靠性越高，本实验的CV值分别为1.89和1.25，均较低，说明实验操作可信。综上表明，该模型能很好地解释响应值的变化。

2.3 验证实验

通过软件Design Expert 7.1.3优化PAEs固相萃取条件得到的理论最佳值为:丙酮正己烷浓度为41.50%、洗脱体积为48.55m L、洗脱速率为7.58r/min，得出的预测值DBP含量26.95mg/kg、DEHP含量17.54mg/kg。考虑实验的可操作性，选取丙酮正己烷浓度为42%、洗脱体积为49m L、洗脱速率为8r/min。根据以上条件进行验证实验，得到的实际值为:DBP含量26.92mg/kg，DEHP含量17.78mg/kg，相对误差小于10%，说明响应面法优化PAEs固相萃取条件是可行的。

2.4 回收率实验

采用加标回收实验评价本方法的可靠性，对样品进行了高、中、低3个不同水平的标准品添加回收实验，每一水平分别做3次平行实验，计算平均回收率和标准偏差。称取9份2g混合均匀食用油样品，事先测定样品的背景值。加入5、10、15mg/L的PAEs混合标准溶液2m L，按照前处理方法进行处理，测定含量，结果见表5。由表5可知，PAEs的3个不同水平的标准品添加回收实验回收率在94.67%～101.83%之间，标准偏差在1.78%～2.77%之间，说明本方法准确可靠。

表5 加标回收实验结果

3 结论

利用响应面分析法能快捷有效地对PAEs的固相萃取条件进行优化。本实验得出PAEs的最佳固相萃取条件为丙酮正己烷浓度42%，洗脱体积49m L，洗脱速率 8 r/m in，DBP 萃取量 26.92mg/kg，DEHP萃取量17.78mg/kg，与优化前单因素实验结果相比，有较大提高。在 5、10、15mg/kg添加水平，PAEs的回收率在94.67%～101.83%之间，相对标准偏差1.78%～2.77%，本方法准确可靠。

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［2］Eve M，Russell C C，Paul mD.Male reproductive tract maliformations in rats folloeing gestational and lactational exposure to di(n2butypl)phthalate:an antiandrogenic mechanism［J］.Toxicol Sci，1998，43(1):47－48.

［3］宋晓峰.医用塑料增塑剂DEHP安全性研究及对策［J］.国外医学卫生学分册，2005，32(6):358－361.

［4］李明元，胡银川.食品塑料包装中PAEs迁移危害研究现状［J］.食品与生物技术学报，2010，29(1):14－17.

［5］刘慧杰.邻苯二甲酸酯类化合物的毒理学效应及对人群健康的危害［J］.第三军医大学学报，2004，26(19):1778－1781.

［6］靳秋梅.邻苯二甲酸酯类化合物的生殖发育毒性［J］.天津医科大学学报，2004(10):15－18.

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Study on the solid phase extraction method of PAEs in plastic bottled edible oil

HU Yin－chuan，LI Ming－yuan*，XIE Hui，QIU Yi－wen

(College of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China)

In order to accurately detect the pollution of phthalic acid esters in plastic bottled edible oil，soild phase mircroextraction condition was studied by response surface methodology.The effects of different elution solvents，elution volumes，elution rates and ratio Florisil on yield of extraction of PAEs were discussed.The Box－Behnken design was applied to fit a response surface function，which based on the one－variable－at－time design.The optimal levels were as follows:the ratio of acetone to hexane was 42%，the elution volumes was 49m L，the elution rate was 8r/m in.The recovery rate of the phthalic acid esters at5，10，15mg/kg addition were ranged from 94.67%to 101.83%，the relatively standard deviation was in 1.78%～2.77%.The Box－Behnken can be used on the extraction of PAEs from cooking oil，and the result was better than that in the one－variable－at－time design.

SPE;PAEs;cooking oil;GC－MS;response surface methodology

TS207.3

A

1002－0306(2011)08－0404－04

2010－07－27 *通讯联系人

胡银川(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:食品卫生安全。

四川省教育厅自然科学重点项目四川省食品生物技术重点实验室开放基金(SZJJ2009－013);西华大学研究生创新基金(YCJJ200940)。