李思斯，江 波，张 涛，沐万孟，缪 铭(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

银杏外种皮总黄酮的提取及其抗氧化活性研究

李思斯，江 波*，张 涛，沐万孟，缪 铭
(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

以乙醇体积分数、温度、浸提时间、固液比为考察因素，对银杏外种皮黄酮的提取工艺进行单因素及正交实验优化，以比色法测定其含量，确定最佳提取条件，并对银杏外种皮总黄酮的抗氧化性进行了初步研究。结果表明，银杏外种皮总黄酮的较优提取条件为:乙醇体积分数80%，温度70℃、液固比25∶1，浸提时间2h，此时提取率为91.01%。银杏外种皮总黄酮具有良好的体外抗氧化能力。当黄酮浓度为0.75mg/mL时，和0.10mg/mL的抗坏血酸的还原能力相当。银杏外种皮总黄酮清除DPPH·、O－2·和·OH的半数抑制浓度各为0.1654、0.8519、0.3843mg/mL。

银杏外种皮，总黄酮，提取，抗氧化，自由基

黄酮是银杏叶及其外种皮中最重要的有效成分之一。由银杏叶开发而成的银杏提取物及其制剂是目前深受人们欢迎的天然药物之一，但是据统计，我国每年约有3万 t左右外种皮作为废物被丢弃［1］。由于被废弃的外种皮长期得不到合理的处置和利用，其中的酚酸类等物质在很多地区已对环境造成严重污染［2－3］。黄酮类化合物具有降压、降血脂、增加冠脉流量、强心、抗心律不齐等药理作用［4］，随着人们不断发现黄酮类物质所具有的生理功能，对其的研究与应用日益增多。因此，从银杏外种皮中提取黄酮类物质，具有广阔的研究与开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏外种皮 购于江苏省泰兴市;芦丁标准品

上海同田生物有限公司，色谱纯;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH) Sigma公司;甲醇、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸钠、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、氯化高铁、三氯乙酸 均为国产分析纯。

DFY－500型中药粉碎机 温岭市林大机械有限公司;调温电热器 上海联营通州市申通电热器厂;HWS12型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;DZG－6050型真空干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;HS7磁力搅拌器 德国IKA公司;Eppendorf AG 5804R离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 银杏外种皮→清洗→晒干→粉碎(过60目筛)→乙醇溶剂浸提→离心(9000r/min)→合并上清液减压浓缩→真空干燥

1.2.2 黄酮的测定 准确吸取样品溶液1m L置于10m L具塞试管中，蒸馏水为空白对照，加体积分数30%乙醇定容至5m L。加入质量浓度50g/L的亚硝酸钠溶液0.3m L，摇匀，放置6min。加入质量浓度100g/L硝酸铝溶液0.3m L，迅速摇匀，放置6m in。加入4m L质量分数40g/L氢氧化钠溶液并用蒸馏水定容至10m L，摇匀。室温显色15min后于510nm波长处测吸光值。

表1 各反应体系溶液组成(mL)

1.2.3 芦丁标准曲线的制作 准确配制0.126mg/m L的芦丁标准液，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L 标准液置于10m L具塞试管中，蒸馏水为对照，按照1.2.2中的测定方法进行测定。以吸光度为横坐标，芦丁标准液浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

由图1得出线性回归方程为y=0.1062x+0.0004，R2=0.9943。

1.2.4 银杏外种皮总黄酮总含量的测定 准确称取1.000g银杏外种皮粉末，加入75m L乙醇，90℃下于索氏抽提器中抽提至抽提液无色后，再换50m L乙醇进行抽提，直到将抽提液滴加到预先滴有10%三氯化铝与氢氧化钠混合液的显色板上时不再显色，则抽提终止［5］。合并两次抽提液，减压浓缩后定容至50m L。按照1.2.2中的方法测定其吸光值，并根据1.2.3的标准曲线计算出黄酮总含量为0.2430mg/m L。

1.2.5 总黄酮提取的单因素及正交实验 采用乙醇回流的方法，选取温度、液固比、浸提时间、乙醇体积分数作为影响因素进行单因素实验。根据单因素实验结果设计正交实验。按照1.2.2中的方法测定提取液的吸光值，并根据1.2.3的标准曲线计算总黄酮含量。

以总黄酮提取率为考察指标，确定银杏外种皮总黄酮的最佳提取工艺条件。

1.2.6 银杏外种皮总黄酮的抗氧化活性研究

1.2.6.1 银杏外种皮总黄酮还原能力的测定［6］取1m L样品，加入2.5m L 0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.6)，2.5m L 1%(w/v)的铁氰化钾溶液;于50℃保温20m in，加入2.5m L 10%(w/v)三氯乙酸溶液，混匀后650 r/m in离心10min，取上清液2.5m L加2.5m L去离子水，0.5m L 0.1%(w/v)氯化高铁溶液，混匀。于700nm处测吸光值。

1.2.6.2 银杏外种皮总黄酮对DPPH·清除能力的测定［7］取1m L样品置于试管中，加入3m L 0.004%DPPH·的甲醇溶液，摇匀，静置30m in，517nm测吸光度。

式中:A样品:加入样品后反应体系的吸光值;A对照:未加入样品的DPPH·乙醇溶液的吸光值;A底:样液本身在同等条件下的吸光度值。

1.2.6.3 银杏外种皮总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力的测定［8］所用溶液均用重蒸水配制:0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷－盐酸(Tris－HCl)缓冲液(pH=8.2)，3mmol/L邻苯三酚溶液。按照表1加入试剂，其中邻苯三酚应最后加入，加入后立即迅速混匀于320nm波长下进行扫描，每隔30s记录一次吸光值。

式中:S空白:邻苯三酚的自氧化速率;S样品:加入样品的反应体系氧化速率。

1.2.6.4 银杏外种皮总黄酮对羟基自由基清除能力的测定 采用改进的Fenton法［9］，4.0m L样品溶液，加入1.2m L 20mmol/L水杨酸钠，4.0m L 1.5mmol/L硫酸亚铁溶液和2.8m L 6mmol/L过氧化氢，迅速混匀，37℃恒温水浴1h。加入蒸馏水作为空白，510nm处测吸光值。

式中:A样品:加入样品后反应体系的吸光值;A空白:加入蒸馏水的反应体系的吸光值;A底:样液本身在同等条件下的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 银杏外种皮总黄酮提取的单因素实验结果

2.1.1 提取温度对银杏外种皮总黄酮提取率的影响

称取银杏外种皮1.00g，在乙醇体积分数70%，液固比20∶1，提取时间2h，回流提取3次的条件下，考察提取温度对提取率的影响。

由图1可以看出，黄酮类化合物在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，同时由于温度升高，浸提液粘度减少，扩散系数增加，促使浸提速度加快。从图1还可以看出，黄酮提取率随提取温度的升高而增大，但超过70℃后，反而呈下降趋势，因为黄酮在高温下受热易被氧化，且温度过高时，热能消耗大，提取液中的活性成分也易被破坏，杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，成本费用增大，综合各方面因素考虑，浸提温度以70℃左右为宜。

2.1.2 浸提时间对银杏外种皮总黄酮提取的影响称取银杏外种皮1.00g，在乙醇体积分数70%，液固比20∶1，提取温度70℃，回流提取3次的条件下，考察提取时间对提取率的影响。

图1 提取温度对总黄酮提取率的影响

从图2可以看出，在最初的2h内，银杏黄酮提取率随时间的延长而上升，当达到2h后，提取率达90%。时间的延长对浸提效果影响不大，黄酮提取效果随时间变化趋势平缓，其原因可能是浸提液中黄酮浓度已基本与外种皮中黄酮浓度达到平衡。

图2 浸提时间对总黄酮提取率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对银杏外种皮总黄酮的影响称取银杏外种皮1.00g，在提取温度70℃，提取时间2h，液固比20∶1，回流提取3次的条件下，考察乙醇体积分数对提取率的影响。

由图3可以看出，浸提溶剂的浓度会影响溶剂的极性，所以会对银杏黄酮的溶解和浸提有一定的影响。当乙醇体积分数较低时，增加乙醇含量使得总黄酮提取率上升，但在乙醇体积分数超过70%后，反而不利于总黄酮的提取。

图3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.1.4 液固比对银杏外种皮总黄酮的影响 称取银杏外种皮1.00g，在乙醇体积分数70%，提取温度70℃，提取时间2h，回流提取3次的条件下，考察液固比对提取率的影响。

银杏外种皮提取率随液固比的增大而增大，但在20∶1后增幅变慢，提取率随液固比变化不太明显，由于后续工作需浓缩，故而为节约时间考虑，选择20∶1较适宜。

2.2 银杏外种皮总黄酮最佳提取条件的确定

图4 液固比对总黄酮提取率的影响

由表2可见，各因素作用的主次顺序是:乙醇体积分数＞温度＞液固比＞浸提时间。乙醇体积分数是主要因素，且随着乙醇体积分数的增大，提取率提高，但乙醇体积分数过高，易将原料中的脂肪提出;其次是提取温度，且高温对黄酮的活性有一定影响，也可能是填充于细胞壁间的不溶性高分子非糖物质变成可溶性胶体物质而进入提取液中［10］;再次是液固比，因为浸提液在后续工作中需要浓缩，若初期加水量过大会影响后续工序，使能耗增加，效率降低。综合考虑，最终选取乙醇体积分数80%，温度70℃，液固比25∶1，浸提时间2h，以此条件进行提取，得提取率为91.01%。

表2 正交实验结果

2.3 银杏外种皮总黄酮抗氧化能力的测定结果

2.3.1 银杏外种皮总黄酮的还原能力 如图5所示，银杏外种皮黄酮对三价铁离子的还原能力随其浓度上升而提高。当黄酮浓度为 0.75mg/m L时，和0.1mg/m L的抗坏血酸的还原能力相当，表明银杏外种皮总黄酮具有较强的还原能力。

图5 银杏外种皮总黄酮的还原能力

2.3.2 银杏外种皮总黄酮对自由基的清除能力 如图6所示，银杏外种皮总黄酮对DPPH·有明显的抑制作用，其清除率在0～0.2mg/m L浓度范围内几乎呈线性上升。当溶液浓度大约0.6mg/m L时，清除率随浓度增大而上升的趋势缓慢，表明此时溶液中大部分的DPPH·均被清除。试样在0～1.75mg/m L范围内随浓度的增加，对超氧阴离子清除能力增强，直至浓度大于2mg/m L时，清除率变化缓慢，此时体系内大部分·已被清除，表明它有良好的清除·的作用。同样随着样液浓度的增加，对羟基自由基清除能力也随之提高，变化趋势与清除其他两种自由基的变化趋势相似。表明银杏外种皮总黄酮中含有供氢体，具有提供氢质子的能力，可使得具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应，达到抑制甚至清除自由基的目的。

图6 银杏外种皮总黄酮对DPPH·、·和·OH的清除能力

从表3中可以看出，DPPH·的IC50最小，只有0.1654mg/m L;其次是·OH的，最后是·。这表明银杏外种皮总黄酮样品对自由基的清除能力大小排序为:DPPH·＞·OH＞O2－·。

表3 银杏外种皮总黄酮清除DPPH·、·和·OH的半数抑制浓度

表3 银杏外种皮总黄酮清除DPPH·、·和·OH的半数抑制浓度

自由基类型 回归方程 相关系数(R2)IC50(mg/mL)DPPH· y=19.873Ln(x)+85.758 0.9791 0.1654 O－2· y=25.17Ln(x)+54.034 0.9322 0.8519·OH y=19.616Ln(x)+68.758 0.9855 0.3843

3 结论

经单因素实验及正交实验，确定银杏外种皮的较优提取条件为:乙醇体积分数80%，温度70℃，液固比25∶1，浸提时间2h，此时的提取率为91.01%。四个因素对提取效率影响大小排序为:乙醇体积分数＞温度＞液固比＞浸提时间。

银杏外种皮总黄酮具有良好的抗氧化活性。通过还原力的比较实验表明，总黄酮浓度为0.75mg/m L时与0.1mg/m L的抗坏血酸还原能力相当，表明银杏外种皮总黄酮具有较强的还原能力。对DPPH·、羟基自由基和超氧阴离子自由基三大体系的研究表明，银杏外种皮总黄酮对DPPH·、·和·OH具有明显的清除作用，且可得出量效关系。清除能力大小排序为:DPPH·＞·OH＞·。

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Extraction and antioxidant activities of total flavonoids from ginkgo biloba exocarp

LI Si－si，JIANG Bo*，ZHANG Tao，MU Wan－meng，MIAO ming

(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Total flavonoids in ginkgo biloba exocarp were extracted with ethanol and analyzed for their antioxidant capacities.The effect of ethanol concentration，extraction time，liquid/material ratio and temperature were evaluated for optimizing the extraction procedure of total flavonoids.A maximum extraction rate of total flavonoids of 91.01%was obtained by 2h extraction using 80%ethanol at70℃ with a 25∶1 liquid/material ratio.The total flavonoids from ginkgo biloba exocarp had marked antioxidant activities:at the concentration of 0.75m g/m L，their reducing power was the same as 0.10mg/m L ascorbic acid;their scavenging effect on IC50of DPPH·，O2－· and·OH were 0.1654，0.8519，0.3843mg/m L.

ginkgo biloba exocarp;total flavonoids;extraction;antioxidant activities;free radicals

TS201.1

B

1002－0306(2011)08－0291－04

2010－07－14 *通讯联系人

李思斯(1987－)，女，在读硕士，研究方向:食品加工新技术原理及应用。