李 祝，郁建平，任秀秀，陈 青，周礼红，葛永怡，肖 洋，刘吴娟

(1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025;2.毕节学院环生系，贵州毕节 551700;3.贵州大学化学工程学院，贵州贵阳550025;4.贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550003)

发酵成分对轮枝拟青霉中虫草菌素含量的影响

李 祝1，郁建平1，任秀秀2，陈 青3，周礼红1，葛永怡1，肖 洋4，刘吴娟1

(1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025;2.毕节学院环生系，贵州毕节 551700;3.贵州大学化学工程学院，贵州贵阳550025;4.贵州省产品质量检验检测院，贵州贵阳 550003)

以轮枝拟青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)为材料，通过单因素、正交实验考察不同的发酵成分对提高GZ高产虫草菌素的条件，通过发酵动力学考察GZ菌株的收菌时间。结果表明:以白砂糖2%、麦芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%为发酵培养基，140r/min，26℃，摇瓶培养7d，虫草菌素产量为(69.1±0.921)mg/L。

轮枝拟青霉，虫草菌素，发酵

虫草菌素(cordycepin)是一类首次从蛹虫草中分离出来的核苷类抗菌物［1］，有抑菌、抗肿瘤、抑制病毒、杀虫等作用［2－4］，已经引起了医药学界等的广泛重视。随着市场对虫草菌素的需求越来越多，而野生的蛹虫草中虫草菌素含量不高，一般为0.1%或更低，很难满足商业虫草菌素含量要达2%的要求［5］。随着野生的冬虫夏草的价格一路上涨，目前已经涨至20万元/kg左右，使野生蛹虫草受到疯狂采摘。所以从资源保护方面考虑，寻找能够产虫草菌素的蛹虫草替代菌株，扩大虫草菌素的药源，是极需要解决的问题。2003年李祝等人从贵州省贵阳市森林公园土壤中分离鉴定得到一株轮枝拟青霉［6］，经紫外分光光度法和高效液相色谱法测其发酵能够产生虫草菌素，而研究轮枝拟青霉的培养成分优化并确定其生长曲线，是提高发酵产虫草菌素产量的方法。所以选择合适的发酵成分对于提高虫草菌素的产量有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

轮枝拟青霉(Paecilomyces verticillatus GZ) 以下简称GZ，现保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏号:CCTCC，NO:M 209302;蛹虫草拟青霉(Peacilomycesmilitaris 08－03) 以下简称 08－03，现保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏号:CCTCC，NO:M 20100219;PDA斜面培养基 马铃薯200g，切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂 20g，水补足 1000m L，pH 自然，灭菌条件:121℃，30m in;PDA液体培养基 马铃薯200g，切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足1000m L，pH 自然，灭菌条件:121℃，30min;查氏固体培养基 NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，蔗糖 30g，琼脂 17～20g，水 1000m L，pH自然，灭菌条件:121℃，30m in;基础培养基1 蛋白胨2%，不添加任何其他物质，pH自然，灭菌条件:121℃，30m in;基础培养基2 葡萄糖2%，不添加任何其他物质，pH自然，灭菌条件:121℃，30m in;发酵培养基 白砂糖20g，麦芽糖10g，酵母膏20g，牛肉膏30g，水补足1000m L，pH自然，灭菌条件:121℃，30m in;虫草菌素 3'－deoxyadenosine，分析纯，美国Sigma公司;白砂糖，麸皮，鱼粉，黄豆粉 均为市售;其它均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素筛选 碳源的选择:以白砂糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油、麸皮、可溶性淀粉为八种碳源分别加入基础培养基1中，添加量为4%，其中麸皮、玉米粉经煮沸水解20min，过滤取其上清液加入。制备培养基，培养基装量为40%，将种子液以5%(v/v)接种量接入不同培养基中，140 r/m in，26℃，摇瓶培养5d，对比这八种碳源对生物量及虫草菌素产量的影响。

氮源的选择:以蛋白胨、酵母膏、NaNO3、乙酸铵、鱼粉、黄豆粉、牛肉膏、(NH)2SO4为八种氮源分别加入基础培养基2中，添加量为4%，其中鱼粉、黄豆粉经煮沸水解20m in，取其上清液加入。制备培养基，培养基装量为40%，将种子液以5%(v/v)接种量接入不同的培养基中，140r/min，26℃，摇瓶培养5d，对比这八种氮源对生物量及虫草菌素产量的影响。

1.2.2 碳氮比的选择 分别选出虫草菌素产量最高的两种碳源、氮源，不加其他任何成分，按四因素三水平设计正交实验，考察不同碳氮比对虫草菌素产量及生物量的影响。

1.2.3 生长曲线的绘制 将活化好的菌株接种于种子培养液中，26℃，140 r/m in，摇床发酵培养，每天取出3瓶观察其形态，将发酵液和菌丝体一起转置离心管中，4000 r/m in离心20m in，进行菌液分离，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，再离心，如此重复三次。得到基本无培养基的菌丝体，将其置于电热干燥箱中，55℃烘干至恒重，取出并测定其重量，绘制生长曲线。

1.2.4 虫草菌素标准液的制备 精密称取1.00mg虫草菌素，置于10m L容量瓶中，用乙醇溶液溶解定容至刻度，即得虫草菌素标准溶液，置于冰箱内备用。1.2.5 待测液的制备 待测液A液的制备:待发酵完成后，用吸管吸出有机溶剂，经0.45μm油相微滤膜过滤除去杂质后冷藏，待测。

待测液B液的制备:将除去有机相的发酵液和菌丝体一起转置离心管中，4000 r/min离心20m in，进行菌液分离，取其上清液经0.45μm水相微滤膜过滤除去杂质后冷藏，待测。

待测液C液的制备:将除去有机相的发酵液和菌丝体一起转置离心管中，4000 r/min离心20m in，进行菌液分离，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，再离心，如此重复二次。得到基本无培养基的菌丝体，将其置于电热干燥箱中，55℃烘干至恒重，研磨，过60目筛，得菌丝粉。精密称取干菌丝粉0.05g置于试管中，加入20%乙醇10m L，超声处理30m in，经0.45μm水相微滤膜过滤，待测。

1.2.6 虫草菌素的测定 HPLC采用Agilent 1100分析检测，色谱柱采用Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μL praticle size，Scientific systems Inc，AP，USA);紫外检测仪(model:Laballiance 525，Scientific systems Inc.，PA，USA);流动相:10mmol/L KH2PO4溶于甲醇/双蒸水(15∶85)，柱温25℃，流速为1.0m L/m in，检测波长为 259nm，进样量为 10μL，出峰时间为22.3min。

1.2.7 统计分析 所有实验分别进行三次重复，所有数据通过SPSS17(正交实验)和Minitab15(除正交实验外其余实验)分析软件统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 碳源的影响

碳源不仅存在于微生物细胞的原生质及其代谢产物中，而且是生命活动中主要的能量来源，因此，碳源不仅需要量大且是基本的营养元素之一。

表1表明，不同碳源对生物量和虫草菌素产量的影响差异显著(P＜0.05)。碳源的添加均能使GZ的生物量增加，不同的碳源对生物量的影响不同，其中添加白砂糖、麦芽糖后生物量增加明显，但是麸皮最不利于GZ的生长。可见GZ菌株较易于吸收糖类和淀粉类碳源，不易利用纤维素类碳源。

表1 不同碳源的发酵实验结果

白砂糖、麦芽糖作碳源，虫草菌素的产量最高，分别为(30.7±0.311)mg/L和(26.2±0.117)mg/L，因此确定白砂糖和麦芽糖为最适碳源。

2.2 氮源的影响

氮源是合成蛋白质的主要原料，而蛋白质是细胞的主要组成成分，是保持生命的基本物质，因此，氮源是微生物生长所需的主要营养源。

表2表明，不同氮源对生物量和虫草菌素产量的影响差异显著(P＜0.05)。不同氮源的添加均能使GZ菌株生物量增加，不同的氮源对生物量的影响不同，其中添加蛋白胨、牛肉膏增加最明显，NaNO3、乙酸铵、硫酸铵则不易于菌株的生长。这可能是由于:首先，GZ菌株为异养微生物，对无机氮源利用差;其次，乙酸铵和硫酸铵作为氮源被利用时，随着铵盐的吸收，培养基pH发生改变，菌株的生长受到一定影响。

表2 不同氮源的发酵实验结果

表2还显示，不同氮源的添加对虫草菌素的产生有不同影响，一些氮源的添加未见GZ虫草菌素的产生，但有一些氮源的添加能够提高虫草菌素产量。推测GZ产虫草菌素的条件需要某些物质的诱导，蛋白质类物质较利于GZ菌株诱导虫草菌素产生，而铵盐或硝酸盐物质则不利于诱导虫草菌素产生。

牛肉膏、酵母膏作为氮源时的虫草菌素产量最高，分别为(24.3±0.117)mg/L和(27.3±0.211)mg/L，因此确定牛肉膏、酵母膏为最适氮源。

2.3 碳氮比的影响

培养基中的碳源和氮源的相对比例无论是对菌丝生长还是对代谢产物的产生都有着十分重要的意义。

将筛选出来的两种碳源和氮源，根据L9(34)正交实验表安排实验，以虫草菌素含量为检测指标，结果(表3)显示，R值表明白砂糖(A)对虫草菌素产量的影响最为显著，其次为牛肉膏(C)、麦芽糖(B)和酵母膏(D)。各因素的最佳组合为A2B1C3D2，即最佳发酵培养基组成为:白砂糖2%、麦芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%。

表3 L9(34)正交实验结果及极差分析表

2.4 发酵动力学的考察

菌株 GZ 在分别培养 0、1、2、3、4、5、6、7、8d 后，测其生物量和虫草菌素产量。

对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。次级代谢产物来自于中间代谢产物和初级代谢产物，所以，针对不同的代谢产物，其发酵菌丝体收集的时间会有所差异，菌株生长曲线的测定为发酵菌丝体的收集时间提供依据。

图1表明，GZ在发酵的1～2d，生物量随着时间的延长增长十分缓慢(延迟期)，但发酵到第3d，其生物量随着时间的延长增长迅速(指数期)，到第3～4d时生物量增加较为平缓(第一个稳定期)，第5d后生物量又有一次较明显的增加趋势，形成二次生长趋势，发酵到第6～7d时无继续增加的趋势(第二个稳定期)，第8d后GZ菌株生物量则随着时间的延长而下降(衰老期)。

图1 GZ菌株的发酵动力学

GZ菌株在培养第3d(第一个稳定期)时虫草菌素产生，在培养至第3～6d(第二个稳定期之前)，虫草菌素产量得到积累，随着培养时间的延长，虫草菌素的产量增加，在培养第7d(第二个稳定期结束)时含量达到最大，为(69.1±0.921)mg/L，此时，生物量也为最高，为(5.8±0.23)mg/m L，随后降低。由此可见，次级代谢产物的产生和菌株的生长周期有关，次级代谢产物的积累主要是在菌株的稳定期。因此，确定培养7d为GZ菌株最适发酵时间。

3 结论

本研究通过单因素、正交实验及发酵动力学的考察，确定了GZ菌株产虫草菌素的条件，即白砂糖2%、麦芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%为发酵培养基，种子液以5%(v/v)接种量接入，140 r/m in，26℃，摇瓶培养7d，虫草菌素产量为(69.1±0.921)mg/L。

［1］焦彦朝，梁宗琦，刘爱英，等.虫草生物活性物质研究概况［J］.贵州农业科学，1990(3):53－54.

［2］R J苏哈道尼克著.核苷类抗菌素［M］.谢其明，王恕蓉译.北京:科学出版社，1982:476.

［3］汪洪.虫草开发研究中几个问题的探讨［J］.农牧产品的开发，1999(6):12－13

［4］吴洪臻，江伟，马德恩.虫草菌素对小鼠S180瘤抑制作用研究［J］.时珍国医国药，2000，11(10):873－874.

［5］李林，张悦红.生物化学与分子生物学实验教程［M］.化学工业出版社，2006.

［6］Zhu Li，Yanfeng Han，Zongqi Liang.Paecilomyces verticillatus，a new species isolated from soil in China［J］.MYCOTAXON，2006，95(3):133－136.

Effect of the components of medium on the content of cordycepin from Paecilomyces verticillatus mycelia

LI Zhu1，YU Jian－ping1，REN Xiu－xiu2，CHEN Qing3，ZHOU Li－hong1，GE Yong－yi1，XIAO Yang4，LIU Wu－juan1

(1.College of Life Science of Guizhou University，Guiyang 550025，China;
2.Envirenment and Life Science Department of Bijie University，Bijie 551700，China;
3.College of Chemical Engineering of Guizhou University，Guiyang 550025，China;
4.Institute of Products Detection ＆ Determination of Guizhou Province，Guiyang 550003，China)

The optimum media condition for submerged fermentation of Paecilomyces verticillatus GZ was explored to enhance cordycepin content.It was found that the optimum conditions were as follows:2%sugar，1%maltose，3%extraction beef，2%extraction yeast，140r/m in，26℃，fermentation for 7 days，the cordycep in production from GZ mycelia would reach(69.1±0.921)mg/L.

Paecilomyces verticillatus;cordycep in;fermentation

TS201.3

A

1002－0306(2011)08－0223－03

2010－12－20

李祝(1978－)，女，副教授，博士，研究方向:微生物与药物活性研究。

贵州大学引进人才科研基金［贵大人基合字(2008)007号］;贵州省科学技术基金［黔科合J字(2010)2065号］;贵大人基合字(2008)013号;毕节地区马铃薯产业科技合作专项［毕署科［2010］04号］。