蒋玉凤 黄 飞 张建军 刘加群 孙华丽

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理学改变，是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足而在肝内过量沉积的结果[1]。TGF-β及其信号传导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用，TGF-β信号诱导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF） 的表达而促进ECM的合成，诱导金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）表达，阻断基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）对 ECM 的降解[2～4]。RNA 干扰是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白水平及功能。RNAi靶序列的选择很关键,所以，RNA干扰实验通常需要针对一个基因设计多个靶序列的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），以找到最有效的 siRNA 序列[5，6]。本研究旨在针对CTGF和TIMP-1目的基因分别设计3条siRNA，通过转染肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）以筛选有效的抑制序列，为进一步研究CTGF和TIMP-1在肝纤维化发生中的作用以及探索肝纤维化的基因治疗奠定基础。

材料与方法

一、细胞与试剂 大鼠HSC-T6由我院中心实验室冻存；新生小牛血清购自杭州四季青公司；RNA抽提试剂TRIZOL购自上海生工公司；CTGF、TIMP-1RNA干扰序列由上海生工公司合成；CTGF、TIMP-1、GAPDH、I型前胶原（Procol-α1）、无关序列（silence）引物由上海博尚生物技术有限公司合成；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自FINNZYMES公司；转染试剂KeyGenTransIII购自凯基生物科技发展公司；III型前胶原、粘连蛋白、透明质酸放射免疫分析试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司；TGF-β1购自美国Cytokines公司。

二、大鼠CTGF和TIMP-1基因干扰靶位设计 在NCBI Gen Bank数据库中，在线查询大鼠CTGF和TIMP-1基因序列。CTGF基因序列的Accession number为 AF120275；TIMP-1基因序列的Accession number为NM-053819。然后，在晶赛公司网站在线设计RNA干扰靶位，通过计算机软件，各选取3段，同时设计阳性对照（GAPDH/r基因干扰靶位）和阴性对照（无关干扰序列），见表1。……