刘全喜 董超颖 李丽君 孙捷 李春云 李亮

肺癌为常见的恶性肿瘤之一,数十年来肺癌的发病率和死亡率有明显的增高趋势[1].Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis family of protein, IAP)家族新成员[2],可选择性地表达于恶性肿瘤组织中,而在除胸腺和生殖腺外的正常成人组织中不表达,这种特点使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点.近年来,随着肿瘤分子生物学的发展以及对基因功能的深入研究,人们逐渐认识到基因治疗后对肿瘤细胞命运起主要决定作用的是基因型,而非制剂的基因毒性,肿瘤细胞相关基因的表达水平是造成患者对同一化疗药物敏感性不同的主要原因[3].迄今为止,尚无科学研究比较分析不同肺癌细胞株小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制survivin表达的效果.因此,本实验将survivin siRNA转染两种肺癌细胞SPCA1和SH77,检测其对肺癌细胞增殖抑制作用的不同.

1 材料与方法

1.1 实验材料 根据真核表达载体pSi-survivin和pSiscrambled的构建[4]设计survivin siRNA和scrambled对照cDNA序列,以pGCsi U6/Neo/GFP为载体,构建表达载体测序鉴定.Survivin siRNA靶基因的cDNA序列(编码基因368-386)为5′-GCAGttTGAAGAAttAAC-3′.

人肺腺癌细胞SPCA1和SH77来源于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC).用含10%小牛血清RPMI-1640培养基,其内加入2 mmol/L的谷氨酰胺+0.05 mmol/L 2-巯基乙醇(2ME)+10%胎牛血清(胎牛血清).保持细胞浓度为2X104个/mL-9X104个/mL,在37oC、5%CO2饱和湿度的条件下培养.用甘油作为其冷冻保护剂.2.5 g/L胰酶消化传代.实验时取对数生长期细胞.首先将细胞在10%FCS中培养2 d.然后每2天通过离心、洗涤6次且以传代的方式收集细胞.

利用Qiagen去内毒素质粒提取试剂盒,大量提取去内毒素的重组质粒pSi-scrambled和pSi-survivin.接种SPCA1和SH77细胞……