陈志红 安社娟 谢至 严红虹 陈剑光 苏健 张绪超 牛飞玉 郭伟浜 吴一龙

p53基因是迄今为止发现的与人类多种肿瘤相关性最高的基因。野生型p53基因是一个肿瘤抑制基因，而其突变型则具有致癌作用，p53基因突变广泛分布外显子5-8，可达95%-98%[1,2]。但p53的突变热点较多，比较分散，目前通常采用组织DNA直接测序法检测p53基因突变，费时且昂贵，无法满足临床需要。本研究旨在建立高分辨熔解曲线（high resolution melting, HRM）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者p53基因突变的方法[3,4]，探讨p53基因突变的特点及其在NSCLC发生发展中的演变规律。

1 材料与方法

1.1 标本来源 病例组为2007年-2009年广东省人民医院的NSCLC患者肿瘤标本，共264例，均为汉族，男184例，女80例，年龄23岁-88岁，均经病理学诊断确诊，且在知情同意后签署了知情同意书。对照组为肺癌患者的癌旁组织标本，共54例，均为汉族，男38例，女16例，年龄28岁-62岁。

1.2 主要试剂与仪器 HRM分析必需试剂：LightCycler 480 High Resolution Melting Master（瑞士Roche公司）；其它试剂和仪器：DNA 抽提试剂盒（上海华舜公司）、pGEM-T（美国Promega公司）、Gel Extraction Kit（德国Qiagen公司）、BIGDYE （美国Applied Biosystems公司）、核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）、PCR扩增仪（美国BD公司）、LightCycler 480荧光定量分析仪（瑞士Roche公司）、ABI3100测序仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集和DNA提取 组织在手术切除后快速冻存于液氮中，-80oC保存待用。将冰冻切片评估肿瘤组织含量＞50%的标本用于检测。组织样本（50 mg）中的DNA提取按照基因组DNA 抽提试剂盒说明书操作。使用Eppendorf核酸蛋白测定仪测定DNA纯度及含量，要求吸光度（A）值280/260＞1.80，调整DNA浓度至5 ng/μL。

1.3.2 HRM检测 按照文献[5]设计p53基因突变检测引物，外显子5-8的引物序列见表1。所有引物均由大连宝生物公司合成，用HPLC进行纯化。……