齐 战，杨大运

(河北医科大学第四医院，石家庄 050011)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，参与对细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、G蛋白偶联受体和NF-κΒ 信号通路的调控。研究发现［1，2］RKIP 在多种肿瘤中呈低表达或表达缺失，被作为是一种新的肿瘤转移抑制基因。2009～2011年，我们采用RTPCR和甲基化特异性PCR(MSP)法观察肺癌组织与相应癌旁肺组织中RKIP基因表达情况及其启动子区甲基化状态，分析RKIP基因表达及其甲基化状态与肺癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 83例新鲜肺癌手术标本(每例分别取癌组织及癌旁正常组织)，均经病理组织学检查证实。男48例，女35例;年龄33～75岁，平均53.7岁。其中吸烟(吸烟＞5支/d、连续＞2 a)者43例，非吸烟者40例。临床分期:Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;有淋巴结转移者43例，无转移者40例。标本均于术中离体0.5 h内取材，立即置入液氮速冻罐中，于－80℃低温冰箱中保存备用。

1.2 RKIP基因及其甲基化率检测方法

1.2.1 RKIP基因 采用 RT-PCR法。用 Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺组织中总RNA，经DNA酶消化后逆转录，行PCR扩增。引物序列为RKIP:上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC G-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。RKIP扩增条件:95 ℃ 3 min，94℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30 个循环，延伸72℃ 5 min，4℃终止，扩增片段长度为236 bp。取5 μl产物加1 μl溴酚蓝，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.2.2 DNA提取和亚硫酸氢钠修饰 采用蛋白酶K-苯酚抽提法提取肺癌及癌旁肺组织中总DNA［3］紫外分光光度计检测总DNA含量和纯度(A260/A280＞1.8)，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。亚硫酸氢盐处理修饰，用DNA纯化试剂盒纯化(按说明书操作)后，将DNA重悬于50 μl水中，水浴、沉淀、回收、干燥后，重悬于50 μl水中，－20℃用箔包裹保存。……