孙雪飞，裴艳涛，尹秋伟，杨国涛，吴铭生

(山东大学齐鲁医院，济南 250012)

藤梨根为软枣猕猴桃的根，味甘、咸寒、微涩，具有清热解毒、消肿疥、祛风湿的功效。既往常用于抗肿瘤治疗，尤其对消化道肿瘤疗效较佳。我们以往的研究发现，藤梨根乙酸乙酯提取物对体外培养的肺癌细胞有较好的抑制作用［1］。2009年10月～2010年5月，我们以此为基础，观察了藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用，并对其作用机制进行了探讨。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌A549细胞系由山东省医学科学院基础所惠赠。TUNEL试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、鼠抗人Survivin单克隆抗体均购自北京中山生物技术有限公司;RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;溴化乙锭(BE)、胰蛋白酶为美国Sigma公司产品;捷达801系列形态学分析系统为江苏捷达科技发展有限公司产品;RNA提取液(TRIzol)购自Life Technologies公司;RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司;BioPhotometer型微量核酸定量仪为Eppendorf公司产品;MJ-PTC200 PCR仪为MJ research公司产品。藤梨根乙酸乙酯提取物自行制备。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 肺癌A549细胞培养在含10%小牛血清，青霉素及链霉素各100 U/ml的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。以二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，将藤梨根乙酸乙酯提取物浓度在临用前用RPMI 1640培养液分别配制为40、80、160 μg/ml，并以其浓度分组，为实验组;同时设对照组(0.04%DMSO+细胞)。取对数生长期的肺癌A549细胞用于实验。

1.2.2 肺癌A549细胞DNA裂解片断的检测 取肺癌A549细胞，调整细胞密度为5.0×105个/ml，接种于含RPMI 1640培养液的25 ml培养瓶中，每瓶3 ml。培养24 h后更换培养液，实验组分别加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物，并设对照组(0.04%DMSO+细胞)，CO2孵箱内培养48、72 h后，分别收集1×106个细胞，DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带。

1.2.3 藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞凋亡率的影响 将经多聚赖氨酸处理的小载玻片预先置于12孔细胞培养板中，取肺癌A549细胞，调整细胞密度为1.0×105个/ml，接种细胞于培养板。待细胞贴壁生长良好时，弃原培养液，分别加入新配制的40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物 3 ml，每个浓度设3个复孔，并设对照孔(0.04%DMSO+细胞)。置于培养箱分别中培养24、48、72 h，弃去孔内培养液，取出载玻片上，晾干，4%多聚甲醛固定15 min(4℃)。采用TUNEL检测用药后肺癌A549细胞凋亡率的变化。

1.2.4 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞Survivin蛋白表达 将经多聚赖氨酸处理的小载玻片预先置于12孔细胞培养板中，取肺癌A549细胞，调整细胞密度为1.0×105个/ml，接种细胞于培养板。待细胞贴壁生长良好时，弃原培养液，加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物 3 ml，并设对照孔(0.04%DMSO+细胞)，每组设3个复孔。置于培养箱分别培养24、48、72 h，弃去孔内培养液，取出载玻片上，晾干，4%多聚甲醛固定15 min(4℃)。采用免疫组化SP法检测藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞Survivin蛋白表达。组织抗原修复采用微波抗原修复法;Survivin蛋白单抗工作浓度均为1∶100。采用已知阳性对照片作阳性对照;以PBS代替一抗作阴性对照。Survivin蛋白阳性染色反应为胞质内见黄色或棕黄色颗粒。将其置于Olympus显微镜下400倍高倍视野下观察，对所测部位进行准确定位后，由摄像系统提取数值化细胞图像输入捷达801系列形态学分析系统，选取4个视野进行阳性率测定。

1.2.5 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞Survivin mRNA的表达 取肺癌A549细胞，调整细胞密度为1.0×106个/ml，接种于24孔培养板中，每孔1 ml，培养24 h待细胞贴壁生长良好时，弃原培养液，加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物，并设对照孔(0.04%DMSO+细胞)，每组设3个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度下分别培养24、48、72 h，收集细胞总数约为1×106个。采用RT-PCR法对藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549细胞Survivin mRNA表达进行半定量分析。设β-actin为内参照，Survivin上游引物序列为 5'-CAAAGAAAGTCCGCTGTGCC-3';下游引物序列为5'-TCCCTCACCCTGCTAAGTCC-3';扩增片断为大小326 bp。β-actin上游引物序列为5'-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3';下游引物序列为5'-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3';扩增产物大小为224 bp。上述引物序列均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，结果以表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后DNA裂解片断比较 对照组细胞DNA凝胶电泳未见明显的DNA梯状条带图谱。用药48、72 h后3种浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后的细胞DNA凝胶电泳均出现凋亡细胞所特有的DNA梯状条带图谱，即180～200 bp及其整数倍数的DNA片段成梯状排列。

2.2 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同时间对肺癌A549细胞调亡率、Survivin蛋白表达及Survivin mRNA表达的影响 见表1。

表1 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同时间对肺癌A549细胞调亡率、Survivin蛋白及mRNA表达的影响()

表1 不同浓度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同时间对肺癌A549细胞调亡率、Survivin蛋白及mRNA表达的影响()

注:与对照组比较，*P＜0.01;实验组中各浓度比较无统计学意义，但存在量效—时效梯度

组别 n 凋亡率(%)24 h 48 h 72 h Survivin蛋白表达(%)24 h 48 h 72 h Survivin mRNA 的表达24 h 48 h 72 h对照组 3 2.06 ±0.45 2.53 ±0.67 2.83 ±0.64 35.82 ±1.9635.88 ±2.3735.52 ±3.04 0.716 ±0.069 0.785 ±0.057 0.790 ±0.042实验组40 μg/ml 3 9.45 ±1.87*14.23 ±3.33*29.55 ±4.42* 29.73 ±2.6122.57 ±2.80*16.46 ±3.91* 0.635 ±0.028*0.541 ±0.097*0.436 ±0.096*80 μg/ml 3 13.74 ±2.34*32.43 ±4.59*44.29 ±3.83* 24.15 ±3.16*19.32 ±3.46*10.36 ±2.54* 0.524 ±0.068*0.466 ±0.087*0.352 ±0.084*160 μg/ml 3 24.38 ±3.61*40.71 ±4.08*53.46 ±4.64* 17.32 ±2.46*12.35 ±2.13*6.56 ±2.04* 0.443 ±0.102*0.364 ±0.080*0.282 ±0.071*

3 讨论

用藤梨根组方治疗肿瘤在我国由来已久，浙江温州地区民间就流传用壁虎(米炒焦研粉)、藤梨根煮红枣治疗胃癌、肺癌，效果较好。近年研究表明，藤梨根复方制剂在体内外均有抑制肿瘤转移［2］、逆转多药耐药［3］、对化放疗减毒增效［4，5］的作用。但上述研究是采用藤梨根复方制剂进行，关于藤梨根单体及其有效成分抗肿瘤研究少见报道。我们既往研究结果显示，藤梨根乙酸乙酯提取物在体外可以诱导肺癌细胞凋亡，但其作用机制尚不明确［1］。本研究采用DNA琼脂糖凝胶电泳及TUNEL技术，再次证实藤梨根乙酸乙酯提取物在体外可以明显促进肺癌A549细胞凋亡，并存在时相性和剂量依赖性。由于细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量减少，因此TUNEL技术可以早期检出未发生形态改变的细胞凋亡，所以本次实验中所得肺癌细胞凋亡率略高于前次流式细胞仪凋亡检查结果［1］，证实诱导肺癌细胞凋亡是藤梨根乙酸乙酯提取物抗肺癌作用的重要机制。

细胞凋亡是受多种基因精细调控的，并通过凋亡相关的信号传导系统介导来实现，因此在接受死亡信号后细胞是否发生凋亡，与凋亡相关基因表达密切关系。除Bcl-2家族外，Survivin作为凋亡抑制因子家族的新成员在细胞凋亡调控中也发挥重要作用。Survivin是迄今为止发现的最强凋亡抑制因子，其高表达能抑制多种因素如p53、Caspases等诱导的细胞凋亡。Survivin可直接作用于Caspase，主要与Caspase-3和Caspase-7结合，阻断细胞凋亡过程［6］。还通过与纺锤体纤维的结合，间接抑制Caspase对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，抑制细胞凋亡［7］。此外，Survivin还可通过与细胞周期调控因子cdk4结合，形成Survivin-cdk4复合体，使p21从cdk4的复合体中释放出来，p21进一步与线粒体Caspase-3结合，抑制其活性，从而抑制 Fas介导的细胞凋亡［8，9］。最近研究发现，热休克蛋白Hsp90可以和Survivin结合，从而提高肿瘤细胞抗凋亡的阈值，促进肿瘤细胞增殖［10］。

本研究采用免疫组织化学和RT-PCR法观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌细胞Survivin基因表达的影响，并对其进行半定量分析，从蛋白和基因水平对其作用机制进行阐述。结果显示，对照组A549细胞Survivin蛋白及mRNA表达水平较高，而经过藤梨根乙酸乙酯提取物处理后A549细胞Survivin蛋白及mRNA表达水平均有下降，并且随着作用时间延长，藤梨根乙酸乙酯提取物浓度加大，藤梨根乙酸乙酯提取物对他们表达的抑制作用逐渐增强，存在量效和时效关系。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以在基因和蛋白水平下调Survivin基因的表达，来诱导A549细胞凋亡，而对凋亡相关基因表达的调控可能是藤梨根乙酸乙酯提取物诱导肺癌细胞凋亡的分子机制之一。本研究在深层次上认识藤梨根的药理作用机制，为更有效地将藤梨根提取物用于临床治疗肺癌提供了实验和理论依据。

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