张 克，姜 维，周 建，陶 然，李溢柔，李 进，马世武*，侯金林

(1南方医科大学附属南方医院，广州 510515;2深圳源兴生物医药科技有限公司)

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)已经应用于肿瘤的临床治疗［1，2］，其体外大量扩增及维持这些细胞的表型和功能，在过继免疫治疗中至关重要。目前体外活化人T细胞的抗CD3单克隆抗体主要包括鼠源性 IgG1(UCHT1)、IgG2a(OKT3)抗体。既往研究发现，同种异型抗CD3单克隆抗体体外刺激 T细胞的结果是不同的［3］，但在体外诱导CIK细胞方面是否存在差异尚不清楚。2011年1月，本研究观察了同种异型抗 CD3单克隆抗体(UCHT1、OKT3)体外扩增 CIK细胞，并比较其对CIK细胞扩增效率、细胞表型及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 淋巴细胞分离液(LymphoprepTM);IFN-γ、IL-1a、IL-2(PeproTech);UCHT1(RδD);OKT3(Cuba CJMAB S.A);PAA淋巴细胞培养液(PAA);CD3-FITC、CD56-PE、CD8-PE-Cy5(BD);25 cm2细胞培养瓶(Corning);CytoTox 96®非放射性细胞毒检测试剂盒(Promega);细胞培养箱(SANYO，MCO-20AIC);流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ);细胞计数仪(CytometerTM，Nexcelom Bioscience);倒置相差显微镜(Nikon ELIPSE Ti)。

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞的体外培养 采集7例健康青年志愿者外周静脉血20 ml，肝素抗凝。常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，细胞计数，加入含1%自体血浆及1000 U/ml IFN-γ的PAA培养基，接种于5 cm×5 cm细胞培养瓶中，细胞密度为2×106个/ml，培养基体积为 5 ml，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，共接种2瓶;第2天，两培养瓶中分别加入50 ng/ml UCHT1、OKT3，并同时加入100 U/ml IL-1α及1000 U/ml IL-2的PAA培养基，定期加入含1000 U/ml IL-2的PAA培养基，调整细胞密度为2×106个/ml。

1.2.2 细胞扩增倍数观察 应用数胞计数仪于培养后第3、7、10、12、14、21 天观察细胞形态并计数，计算细胞扩增倍数(扩增倍数=细胞密度×培养基体积÷接种细胞总量)。

1.2.3 CIK细胞表面标志检测 选取培养基线和培养第14天的CIK细胞，取1×106个细胞……