王旭东,王海珠,徐 华,梁国栋,张 伟,朱宝平,房学东*,姜洪伟

(1.吉林大学第二临床医院普通外科,吉林长春 130041;2.长春中医药大学附属医院;3.内蒙古自治区医院）

本研究探讨结直肠癌组织中RASSF 1A基因启动子甲基化和mRNA表达异常与结直肠癌病理生物学特征的关系,为阐明抑癌基因RASSF 1A基因在结直肠癌发生发展中作用及其分子机理提供有力科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集我院2009年8月-2010年4月手术切除结直癌标本90例,均为腺癌,其中男性55例,女性35例,年龄42-78岁,平均62岁。组织来源和分组:分为三组(1）正常组;(2）癌旁组;(3）实验组。按:①分化程度:分为高、中、低分化组。②肿块大小:＞5 cm和 ≤5 cm。③临床分期:按照Dukes分期进行分组。

1.2 方法

1.2.1 RASSF 1A基因表达的检测:RT-PCR方法检测RASSF 1A基因mRNA表达。

1.2.2 设计引物:针对RASSF 1A基因启动子甲基化特异性PCR所设计的一组引物,使用引物设计软件Primer3,该引物包括甲基化(Methylated,M）与非甲基化(Unmethylated,U）特异性引物各一对,由宝生物工程(大连）有限公司合成。分别以M、U标记,各对引物上下游起始位点、扩增片断大小、引物序列如下:

甲基化引物设计:

M-上游引物:距转录起始点-43 bp至-17 bp

5′-CGTTGTTCGCGATTTTTGGTTTC-3′

下游引物:距转录起始点71 bp至92 bP

5′-ACCGATTACTTTAAAAATACGCG-3′

扩增片断:342 bp

未甲基化引物设计:

U-上游引物:距转录起始点-44 bp至-18 bP

5′-GTTGTTGTTGTTTGTGAITTTTGGTTTT-3′

下游引物:距转录起始点72 bP至99 bP

5′-CCACTTACCAATTACTTAAAAAATACACA-3′

扩增片断:351 bP

1.2.3 MSP测定DNA甲基化:按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 PCR产物行琼脂糖凝胶电泳:条件为2.5%琼脂糖凝胶,65 V恒压电泳1 h 40 min。0.1%嗅化乙锭染色15 min,凝胶成像系统照相分析。

1.2.5 检测甲基化位点状况 MSP产物6 μ l及DNA Marker 1 μ l用含有嗅化乙锭1.5%琼脂糖凝胶(稳压80V）在TBE电泳工作液电泳约20 min,后在紫外灯下观察结果,且用UVI凝胶成像系统摄影。……