蒋莉萍,袁金兰,肖 凤,张万兴,刘 菅

(1.吉安市妇幼保健院 病理科,江西吉安 343000;2.井冈山大学 病理教研室）

葡萄胎(hydatidiform mole,HM）是妊娠滋养层疾病中最为常见的疾病。我国HM的发病率为1∶1 290次妊娠[1]。葡萄胎在＞40岁的妇女最多,并且在那些＜20岁妇女的发病率也有增加。据估计,完全性葡萄胎约20%发展为持续性妊娠滋养细胞疾病,多数发展为持续性或侵袭性胎块,1%-2%的完全性葡萄胎可发展为绒癌。部分性葡萄胎发展为绒癌的危险性非常低,世界上仅有几例记录较完全的报道。由于完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole,CHM）和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole,PHM）的恶变率存在显著的差异,临床上很有必要将两者准确地区别开来。因早期完全性葡萄胎与部分性葡萄胎的组织学表现有许多相似之处,本实验通过免疫组织化学方法首次联合检测P57、P53蛋白在CHM与PHM中的表达情况,寻找高敏感度和高特异性的葡萄胎标志物并探讨两者在诊断中的应用价值及相互关系,为临床诊断和治疗提供分子生物学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象70例水泡状胎块标本,选自2006年-2008年江西省吉安市妇幼保健院病理科归档蜡块,标本均经甲醛固定,石蜡包埋,HE染色。所有病例诊断标准参照WHO(2003）乳腺及女性生殖器官肿瘤分类,HE切片由2名高年资妇产科病理医师读片,排除组织量少诊断有差异的病例。其中,完全性葡萄胎51例,平均年龄28.8岁(19-51岁）;部分性葡萄胎19例,平均年龄26.3岁(19-36岁）;门诊随机选取30例正常早孕胎盘(6-9w）(normal placeta,NP）作为对照,平均年龄27.5岁(19-39）。

1.2 试剂与方法

鼠抗人单克隆抗体P57kip2(单克隆号:25B2）,兔抗人单克隆抗体P53(单克隆号:SP5）和SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组化S-P法。

1.3 结果判定

1.3.1 阳性细胞判定标准 P53、P57染色阳性物质均位于细胞核,呈棕黄色颗粒。免疫组化结果判定经两名高年资的妇产科病理医师交叉阅片综合分析判断。

1.3.2 染色阳性率的计算 先在低倍镜(100×）下选取细胞分布均匀的视野,再在高倍镜(400×）下,用Image-pro plus病理彩色图像分析系统进行分析,分别测出每个视野中阳性肿瘤细胞数与细胞总数,每例分别随机计数5个视野,计算均值,以百分数表示,即阳性率=(阳性细胞数/瘤细胞总数）×100%。

1.3.3 免疫组化结果评分标准采用AB值法,A为阳性细胞数分级:0-1%=0、1-10%=1、10-50%=2、50-80%=3、80%-100%=4;B 为阳性细胞显色强度分级:0(阴性）、1(弱阳性）、2(阳性）、3(强阳性）,每例免疫组化最终评分值HIS=A×B。将HIS最终评分值再分类,以“HIS＜3”判定为“无明显表达”,以“3≤HIS＜5”判定为低度表达,以“5≤HIS＜7”判定为中度表达,以“HIS≥7”判定为高度表达。其中,以“HIS ＜5” 判为低表达,以“HIS≥5”判为高表达;将中、高度阳性表达率作为过表达阳性率。

1.4 统计学分析

数据库的建立和数据分析均采用SPSS13.00软件(采用卡方检验和Spearman等级相关分析）。

2 结果

2.1 P57的表达

P57的定位很有特点,在CHM中仅在绒毛间滋养层细胞岛、蜕膜细胞间偶见点灶状微弱着色。在高度水肿的绒毛间质细胞、细胞滋养层细胞以及绒毛合体滋养细胞P57均不表达,而在PHM中水肿的绒毛间质细胞和细胞滋养细胞P57呈阳性表达,周围形态正常绒毛细胞滋养层细胞、绒毛间质细胞以及绒毛间滋养细胞岛P57也呈阳性表达为,两种绒毛的合体滋养层细胞P57均不表达。表1中,CHM、PHM以及对照组(NP）的P57阳性表达率分别为0%、89.47%、以及100%。其中,CHM与PHM比较差异,χ2=55.500,P＜0.01,有统计学意义;CHM 与NP比较差异,χ2=81.000,P＜0.01,有统计学意义;PHM与NP比较差异,χ2=2.452,P＞0.01,无统计学意义。

2.2 P53的表达

P53蛋白主要在细胞滋养层细胞和中间型滋养细胞中表达,合体滋养层细胞基本不表达。表1中CHM、PHM及NP中P53蛋白的阳性表达率分别为94.12%、42.11%、以及 16.67%,组间两两比较,CHM与PHM比较差异,χ2=20.268,P＜0.01,有统计学意义;CHM与NP比较差异,χ2=50.095,P＜0.01,有统计学意义;PHM 与NP比较差异,χ2=3.862,P＞0.01,无统计学意义。

2.3 在CHM中滋养层细胞不同增生程度间P57蛋白、P53蛋白表达阳性率的差异,无统计学意义(P＞0.05）。见表2。

2.4 P53蛋白与P57蛋白在CHM、PHM 中的相关性,经Spearman等级相关性分析,P＞0.05,无关联性。见表3。

表1 两型葡萄胎组织P53和P57表达情况

表2 完全性葡萄胎组中滋养叶细胞增生程度与P53、P57表达的关系

表3 两型葡萄胎组织P53与P57基因表达的关系

3 讨论

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,其基因产物P53蛋白主要参与转录调节,是细胞生长重要的负调节因子,也是引起细胞程序性死亡的重要原因。在肿瘤早期形成阶段,由于体内外各种致癌因素的作用,P53基因发生缺失突变,使其编码的蛋白质丧失了抑制细胞增殖的功能,导致细胞无限增殖而引发肿瘤。P57kip2又叫有丝分裂因子,是细胞周期抑制因子和肿瘤抑制因子,其编码产物是一种广泛的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK）的抑制蛋白,即称为P57kip2蛋白或P57蛋白。在正常情况下,P57kip2基因为父源性基因印记,母源性基因表达[2]。P57蛋白通过与CDK结合抑制CDK的功能使细胞周期停滞在G1期。因而人们认为,P57kip2可能是一个新型的肿瘤抑制基因,能抑制细胞从G1期到S期的转化[3]。P57kip2基因参与细胞周期调控、促进凋亡、诱导分化[4]。

本实验检测了51例CHM,19例PHM及30例正常早孕胎盘组织中P57、P53的表达情况,结果显示,P57在CHM与PHM组织中的表达分布具有明显的差异。P57在CHM组织中的表达仅位于绒毛间滋养层细胞岛、蜕膜细胞间偶见点灶状的微弱着色,在高度水肿的绒毛间质细胞、细胞滋养层细胞和绒毛合体滋养层细胞P57均不表达。在51例CHM中,P57均呈“无明显表达”。而P57在PHM的表达分布很有特点,即水肿的绒毛间质细胞和细胞滋养层细胞P57阴性表达,周围形态正常绒毛细胞滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛间滋养细胞岛P57阳性表达,两种绒毛的合体滋养层细胞P57均不表达[5]。在PHM水肿的绒毛间滋养叶细胞岛和蜕膜细胞团P57也呈阳性表达,笔者认为,P57在CHM和PHM中绒毛间滋养叶细胞岛和蜕膜细胞团间的表达可能是中间型滋养叶细胞表达。在19例PHM组织中,仅有2例的IHS最终评分值分别为“1”和“2”,可能为抗原丢失了导致表达很弱,其余17例P57的表达以强阳性为主。PHM的阳性表达率为89.47%,而CHM的阳性表达率为0%,有极显著差异,有统计学意义(P＜0.01）。P57在NP中的表达分布与PHM组织中的正常绒毛组织具有相同的特点,其阳性表达率为100%,与PHM比较差异无统计学意义(P＞0.01）,这与细胞遗传学研究结果相一致。CHMS染色体组为二倍体,46XX,其两条染色体均来自父性,P57不表达;PHMS染色体组为三倍体,一条来自母性,两条来自父性,P57表达;正常早孕绒毛组织为正常核型,各来自父系和母系,P57表达。本实验中的CHM与PHM及NP的P57的表达分布的明显差异,提示P57蛋白的检测可作为CHM和PHM鉴别诊断很有效的手段,具有很高的灵敏度和特异性,可以将早期的CHM和PHM区别开来。

本实验结果还显示,在CHM和PHM中P57与P53蛋白的表达均无关联性。然而现在许多肿瘤中均发现P57kip2基因印记缺失或印记错误,导致基因表达下降,这表明其在肿瘤中的表达缺失可能促进了肿瘤的增殖[6]。表2中,在51例CHM 中,由轻度滋养叶细胞增生→中度滋养叶细胞增生→重度滋养叶细胞增生,P53的过表达阳性率由50%→86.67%→100%,虽然三者的比较无差异,无统计学意义(P＞0.01）,P53蛋白表达水平与CHM中滋养层细胞增生程度无关,但其表达水平呈递增趋势,而且从表1中显示从NP→PHM→CHM,P53蛋白的阳性表达率由16.67%→42.11%→94.12%亦呈增高趋势。其中NP与PHM两者比较无差异,无统计学意义(P＞0.01）,CHM与NP及PHM与比较差异有统计学意义(P＜0.01）。Halperin等报道 P53在NP、PHM及CHM中的阳性表达率分别为 30%、50%及100%,Qiao等研究中,P53在NP中的表达低于CHM中。研究结果表明P53蛋白异常表达与葡萄胎组织的发生与进展有关,P53功能异常能明显地促进细胞的增殖,凋亡失衡及恶性转化[7]。以上研究结果与文献报道基本一致。但笔者认为,CHMS中P57不表达,可能还存在其它分子的调控机制,这与P53蛋白的表达趋于加强有无关联,还须待以后进一步的研究证实。

综上所述,P57kip2基因印证缺失或印证错误可能促进了肿瘤的增殖,P53功能异常在HMS发生、发展中起了重要作用。因此,P57蛋白可作为CHM和PHM鉴别诊断的一个客观的辅助指标,P53蛋白也是个有一定临床价值的参考标记,值得在今后病理诊断常规工作中推广使用。

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[5]古聪敏,杜家辉,陈永鸿.印迹基因P57kip2蛋白在水泡状胎块诊断和分型中作用[J].临床与实验病理学杂志,2008,24(3）:349.

[6]刘 淼,张鹏霞,徐 辉,等.P57kip2基因与肿瘤[J].黑龙江医药科学,2006,29(6）:90.

[7]胡建功,敖亚洲,谢朝辉 等.P53与妊娠滋养细胞肿瘤的增殖和调亡[J].基础医学与临床,2007,27(11）,1277.