吴劲松 浙江省湖州市南浔人民医院检验科 湖州 313000

艰难梭菌（clostridium difficile，CD）又称难辨梭状芽孢杆菌，是一种厌氧革兰染色阳性芽孢杆菌，广泛分布于自然环境及动物和人的粪便中，主要通过粪-口途径传播[1-2]。艰难梭菌是引起医源性腹泻的重要病原菌，与大量抗生素使用有关，其感染典型表现是伪膜性肠炎[3-4]。目前全球特别是欧洲和北美艰难梭菌感染的流行暴发迅速增多，严重病例数、复发率和病死率均明显上升，耐药菌株也在增多，给该病的临床诊断和治疗提出新的挑战[5]，因此临床实验室对其快速而准确的识别、鉴定具有重要意义。笔者采用实时荧光PCR方法对艰难梭菌进行快速检测鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌 株 艰难梭菌标准菌株（ATCC9689）及其它引起腹泻致病菌如福氏志贺菌ATCC51311，空肠弯曲菌ATCC33560，产单核李斯特菌ATCC7644，霍乱弧菌ATCC16026，肠出血性大肠埃希菌O157：H7 ATCC43889，沙门菌 ATCC50041／ATCC14028，副溶血性弧菌ATCC20506。均购于中国微生物菌种库。

1.2 粪便标本 278例粪便标本均来自我院2010年1月—2010年12月住院腹泻患者，所有标本采集后均保存于4℃，并在4h内完成检测。

1.3 艰难梭菌毒素检测 采用法国生物梅里埃公司的VIDAS难辨梭菌毒素检测试剂对上述粪便标本艰难梭菌感染情况进行分析。

1.4 基因组DNA提取 菌株基因组DNA提取采用Promega公司WizardGenomic DNA Purification Kit试剂盒，粪便基因组提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA stool Mini Kit试剂盒，按照操作说明进行。

1.5 荧光定量PCR 根据艰难梭菌TcdB基因序列采用Primer Express3.0软件（ABI）设计特异性引物和探针，上游引物：5’-GAAAGTCCAAGTTTACGCTCAAT-3’；下游引物：5’-GCTGCACCTAAACTTACACCA-3’；荧光探针：5’-FAM-ACAGATGCAGCC AAAGTTGTTGAATT-TAMRA-3’。按照以下体系配制反应液：5.0μL10×PCR buffer，7.0μL 25mM Mg2+，4.0μL 2.5mM dNTP，10μM 上下游引物各 2.0μL，10μM 荧光探针 0.5μL，5U/μL Taq 酶 1.0μL，模板DNA 5.0μL，双蒸水补足 50μL；……