杜丽娟 唐学贵 吴至久 李 敏

川北医学院附属医院,四川省南充市 637000

慢传输型便秘的确切病因、发病机制和病理生理的改变现尚未完全明了,目前一系列研究表明,一些胃肠激素血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、5-羟色胺、胃泌素、生长抑素等分泌异常可能与慢性便秘的发病相关[1]。其中血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)作为胃肠动力抑制性神经元,具有松弛胃肠道平滑肌、抑制胃肠蠕动的作用。因此,笔者为了解肠神经递质与慢性便秘之间的关系,选取慢性便秘大鼠模型为研究对象,采用免疫组化技术,检测VIP在慢传输型便秘大鼠模型结肠肌间神经丛的蛋白表达情况,探讨其在慢性便秘发病机制中的作用,期望为临床治疗方案选择提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 60只健康SD大鼠,清洁级,雌雄各半,体重180～250g(川北医学院动物实验中心提供),将动物随机分为正常对照组、慢性便秘模型组,每组30只。

1.2 动物模型建立 参照文献[2]制作大鼠慢性便秘动物模型的方法,并加以改进,将配好的含复方地芬诺酯10mg/kg混悬液4ml灌胃,1次/d,连续灌胃14d,建立大鼠慢传输型便秘模型。正常对照组则以等量生理盐水替代复方地芬诺酯进行灌胃。

1.3 主要药物及试剂 复方地芬诺酯(江苏平光制药有限责任公司);大鼠VIP一抗免疫组化试剂盒(北京博奥森生物有限公司)。

1.4 标本制备 两组大鼠均于末次灌胃后24h,颈椎脱臼法处死,剖腹找到盲肠,剪取近端结肠8～10mm,用4℃生理盐水冲净肠内容物及血液,放入4%多聚甲醛中固定,用于免疫组织化学检测。

1.5 结肠肌间神经丛VIP蛋白的免疫组织化学检测 SP法：组织石蜡切片脱腊,3%H2O2、37℃孵育,PBS冲洗,滴加10%正常山羊血清封闭液孵育,加入一抗为兔抗大鼠抗体(1∶100稀释)孵育,PBS冲洗,滴加二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG孵育,PBS冲洗,滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/H RP)孵育,PBS冲洗,DAB显色,苏木精复染,中性树胶封片。阳性细胞胞浆呈棕褐色。

1.6 结果判定 所有切片均设置阴性对照(不加一抗染色,PBS代替一抗)。免疫组织化学阳性标准：棕褐色染色为阳性表达。随机选取5个高倍视野×400,以显微图像分析系统Image-Proplus 6.0进行图像分析处理测定MD值。

2 结果

2.1 VIP在两组大鼠结肠肌间神经丛表达结果主要表达于结肠肌间神经丛神经元细胞胞浆。VIP在正常对照组大鼠结肠黏膜层及肌间神经丛神经元的胞浆表达呈棕褐色,分布稀疏。与正常对照组相比,模型组大鼠结肠黏膜层及肌间神经丛神经元表达同样也呈棕褐色,但分布较密集,细胞阳性表达染色升高,见图1。

图1 正常对照组与模型组免疫组化VIP表达(×400),A：正常对照组 B：模型组

2.2 两组大鼠MD值比较 两组大鼠结肠肌间神经丛组织VIP蛋白检测结果显示,慢性便秘模型组大鼠肌间神经丛组织V IP蛋白平均光密度值显著高于正常对照组(P＜0.05),见表1。

表1 正常对照组与模型组免疫组化VIP表达平均光密度值(MD)比较()

表1 正常对照组与模型组免疫组化VIP表达平均光密度值(MD)比较()

注：*与正常对照组相比,差异有统计学意义P＜0.05。

分组 例数 VIP正常对照组 30 0.077±0.044模型组 30 0.223±0.025*

3 讨论

慢性便秘主要是以大便排出困难、排便次数少及排便时间延长为主要症状,因为其病因和发病机制目前尚不明确,所以临床治疗效果并不理想[3,4]。近年来研究发现肠神经系统和肠神经递质参与了肠道运动功能的调节,且逐渐成为研究慢性便秘发病机制的热点。

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,V IP)属于胰高血糖素-胰泌素家族,是肠神经系统中的一种主要的抑制性神经递质,VIP的分泌细胞广泛存在于整个胃肠道,其主要作用是增强胃肠黏膜的腺体分泌、松弛胃肠道平滑肌、抑制胃肠蠕动。国内外实验证实V IP是胃肠道重要的神经递质,其分布异常可能与在慢性便秘的发病机制有关[5～7]。笔者研究观察到VIP阳性表达物主要定位于肌间神经丛神经元的胞浆,呈棕褐色,且在慢传输型便秘模型大鼠的结肠肌间神经丛中表达增强,提示VIP与慢传输型便秘的发病机制相关,VIP作为肠神经系统抑制性神经递质,其水平增高可以抑制胃肠道平滑肌收缩及肠肌紧张性,减少胃肠黏膜的分泌活动,从而抑制肠蠕动导致慢性便秘。故理论上可以在临床上选用或研发能够减少肠道VIP的释放的药物,降低肠道VIP水平,促进胃肠道蠕动,从而达到治疗慢性便秘的目的。

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