邹春云 阮 林 张 援

阿片受体激动剂吗啡是临床常用的镇痛药物，广泛应用于各种癌痛患者，疗效确切，但其对肿瘤细胞是促进其生长还是诱导其凋亡尚存在争议［1～4］，这在一定程度上限制了吗啡的临床应用。近年来，阿片受体激动剂芬太尼作为一种常用麻醉性镇痛药物，正逐渐应用于癌痛患者，但该药对肿瘤细胞的影响国内外报道较少。本实验通过观察芬太尼对人肝癌细胞bel-7404增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

枸椽酸芬太尼注射液(批号:090501，湖北宜昌人福药业有限公司)，人肝癌细胞bel-7404引自中科院上海生物研究所，由广西医科大学肿瘤防治研究所培养。主要培养试剂包括小牛血清、RPMI 1640培养液，胰蛋白酶为GIBCO产品，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自吉泰科技有限公司。细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。仪器包括ELX800型全自动酶标仪(BIOKIT公司)、FACScalibur型流式细胞仪(BD公司，美国)和Axiovert200型倒置显微镜(Zeiss公司，德国)等，细胞周期分析软件(Beckman公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞接种于含100μg/m1青霉素、100μg/m1链霉素和10%小牛血清的1640培养液中，置于含5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱中培养。待细胞形成单层铺满70% ～80%时，用0.25%胰酶常规消化，以1∶3～1∶5传代1次。

1.2.2 噻唑蓝还原法(MTT)及显微镜观察细胞形态 将细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×103个/孔，继续培养至细胞长满80%后，弃培养液，4个实验组分别施加浓度为5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各组复设空白对照孔(仅加培养基)，各浓度设4个平行孔。培养24h后，取出96孔培养板，用倒置显微镜观察细胞形态，加入新鲜配制5mg/ml的MTT20μl/孔，孵育4h，吸尽各孔内残余液体，加入二甲基亚砜(DMSO)200μl/孔，振荡10min，使微小黑色结晶溶解，形成均匀蓝紫色溶液。采用酶标仪波长490nm下测定各孔吸光度值(A)，以不加细胞仅加培养基的孔调零。

1.2.3 细胞凋亡检测 收集对数生长期的bel-7404细胞，将2×105/ml细胞接种于6孔培养板，1ml/孔，实验组施加浓度分别为为5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各组复设空白对照孔(仅加培养基)3孔/组，待细胞长到约80%时，收集细胞，参照 annexin VFITC试剂盒说明书方法操作，在488nm的激发波长下采用FACScalibur流式细胞仪分析。

1.2.4 细胞周期分析 收集对数生长期的bel-7404细胞，将细胞以2×105/ml密度接种于6孔培养板，同样设4个实验组与1个对照组，待细胞长到80%后，收集细胞，参照试剂盒说明书操作，采用FACScalibur流式细胞仪进行单色荧光细胞流式计数，用细胞周期分析软件进行细胞周期分析。

1.2.5 克隆形成实验 收集对数生长期的bel-7404细胞，将细胞以1×103/ml密度接种于6孔培养板，芬太尼孵育7 d，以 PBS洗涤细胞2次，甲醇固定5min，结晶紫染色15 min，在Axiovert200型倒置显微镜下观察克隆数，≥50个细胞计为1个克隆，计算克隆形成率，克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差()表示，各样本间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芬太尼对人肝癌细胞bel-7404生长、凋亡与克隆形成率的影响

各实验组人肝癌细胞bel-7404 MTT值和克隆形成率明显低于对照组，细胞凋亡率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01或0.05)。芬太尼浓度≥50ng/ml时，随着浓度的增加，凋亡率逐渐升高，MTT值、克隆形成率逐渐降低，各实验组间两两比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 各组MTT值、细胞凋亡率及克隆形成率结果()

表1 各组MTT值、细胞凋亡率及克隆形成率结果()

注:对照组与各实验组比较，*P＜0.05。

组别MTT值(n=4)凋亡率(%)(n=3)克隆形成率(%)(n=3)对照组 0.609±0.015* 10.71±1.8* 12.59±0.32*F1 0.572±0.010 26.27±2.08 10.48±0.43 F2 0.546±0.006 28.88±1.06 8.06±0.37 F3 0.502±0.007 32.10±1.4 6.66±0.28 F4 0.481±0.007 47.27±1.33 4.48±0.45

2.2 芬太尼对细胞周期的影响

各实验组对bel-7404细胞周期的作用不完全相同(P＜0.01)，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，细胞周期分析显示芬太尼干预细胞后实验组随浓度增加，G0/G1期比例逐渐增加，S期、G2/M期细胞比例逐渐减少，与对照组比较，各实验组在G1期均有显著统计学差异(P＜0.01)，G2期除5ng/ml与500、5 000ng/ml组间差异有统计学意义(P＜0.01)外，其余各实验组间两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，S期除5ng/ml与50ng/ml组两者间差异无统计学意义(P=0.07)外，其余各实验组间两两比较，差异均有显著统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同浓度的芬太尼对人肝癌bel-7404细胞周期的变化(，%)

表2 不同浓度的芬太尼对人肝癌bel-7404细胞周期的变化(，%)

注:对照组与各实验组比较，*P＜0.05。

组别 G1 G2S对照组 48.60±1.54* 19.37±1.2* 32.06±1.45*F1 62.98±2.08 10.96±1.12 26.06±1.08 F2 66.85±1.07 9.30±0.89 23.84±0.39 F3 71.05±1.38 8.18±0.88 20.71±2.15 F4 75.64±1.89 7.74±0.91 16.62±1.00

2.4 细胞形态观察

倒置显微镜下观察对照组细胞贴壁生长，细胞呈多角形或梭形，细胞质丰富，生长旺盛，相邻细胞生长融合成片。加入不同浓度的芬太尼后，随着浓度增加和作用时间延长，细胞开始变小、变圆，折光性增强，脱壁细胞逐渐增多，漂浮在培养基中。见图1a，1b。

图1a 对照组细胞形态(10×40)

图1b 实验组不同芬太尼浓度下细胞形态(10×40)

3 讨论

芬太尼作为一种临床常用的阿片受体激动剂，其广泛的药理作用受到越来越多的关注，在治疗恶性肿瘤方面，有研究表明该药能明显抑制MCF-7细胞的增殖［5］，并可抑制人胃癌细胞活力［6］，但该药对 bel-7404细胞是否存在抗增殖效应尚未见报道。本研究结果表明，各实验组人肝癌bel-7404细胞MTT值和克隆形成率明显低于对照组(P＜0.01)，提示不同浓度的芬太尼对bel-7404细胞的生长均有抑制作用。当芬太尼浓度≥50ng/ml时，随着浓度的增加，凋亡率逐渐升高，MTT值、克隆形成率逐渐降低，提示高浓度的芬太尼对bel-7404细胞的生长具有更加明显的抑制作用。在形态学方面，本研究发现，经芬太尼处理的细胞，其活力下降，细胞变小且形态不均，贴壁能力降低，且呈剂量依赖性特征。

为了进一步了解芬太尼引起bel-7404细胞凋亡的机制，我们用流式细胞仪检测实验组细胞周期的变化，发现实验组bel-7404细胞出现明显的G0/G1期细胞周期阻滞，静止期(G0/G1期)细胞增多，DNA合成活跃期(S期)和有丝分裂(G2/M)期细胞减少，反映细胞增殖状况的S期细胞比率在经芬太尼处理24h后明显降低，表明芬太尼能抑制bel-7404细胞从G0/G1期向S期的转化。由于细胞的增殖速度主要与G1期的长短有关，阻滞细胞从G1期进入S期就可以抑制细胞增殖。因此，芬太尼抑制人肝癌细胞bel-7404生长的原因之一可能是抑制细胞从G0/G1期向S期转化，结果与部分报道一致［5］。但也有研究表明［7］，阿片类药物可以与细胞表面μ受体结合，β受体进而与G蛋白三聚体结合，促进细胞内NO产生和释放，下调NK-KB和bcl-2的表达，上调bax和p53的表达，从而诱发细胞凋亡。刘志恒等［8］研究也推测，芬太尼诱导细胞凋亡的机制可能是通过与细胞表面μ受体结合而发挥作用。由此可见，芬太尼可能具有组织特异性及肿瘤选择性，对不同肿瘤的作用方式不尽相同。

综上所述，芬太尼在体外可剂量依赖性抑制人肝癌bel-7404细胞生长并促进其凋亡，其机制之一可能是诱导细胞周期，尤其是G0/G1期阻滞。

［1］ Biji M，Lennon F，Siegler J ，et al.The novel role of the muopioid receptor in lung cancer progression:A laboratory investigation［J］.Anesthesia and Analgesia，2011，112(3)∶558-567.

［2］ Franchi S，Panerai AE，Sacerdote P.Buprenorphine ameliorates the effect of surgery on hypothalamus-pituitary-adrenal axis，natural killer cell activity and metastatic colonization in rats in comparison with morphine or fentanyl treatment［J］.Brain，Behavior，and Immunity，2007，21(6)∶767-774.

［3］ Mouedden M，Meert TF.The impact of the opioids fentanyl and morphine on nociception and bone destruction in a murine model of bone cancer pain［J］.Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2007，87(1)∶30-40.

［4］ Hatsukari I，Hitosugi N，Ohno R，et al.Induction of apoptosis by morphine in human tumor cell lines in vitro［J］.Anticancer Research，2007，27(2)∶857-864.

［5］ 张咸伟，丁汉琳，张传汉.芬太尼对MCF-7细胞增殖和细胞周期影响研究［J］.中国医师杂志，2005，7(1)∶23-25.

［6］ 覃 怡，利 莉，陈 静.芬太尼对人胃癌MGC-803细胞活力的影响［J］.中华麻醉学杂志，2010，30(6)∶705-707.

［7］ Notas G，Kampa M，Nifli AP，et al.The inhibitory effect of opioids on HepG2 cells is mediatedvia interaction with somatostatin receptors［J］.European Journal of Pharmacology，2007，555(1)∶1-7.

［8］ 刘志恒，高 峰，田玉科.吗啡、芬太尼、曲马多对Jurket细胞核因子κB和IL-2合成的影响［J］.中国医院药学杂志，2007，27(1)∶579-582.