路秀英 李晓明

缺氧是人类和动物实体肿瘤的一个共同特征。低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是机体在低氧条件下产生的一个转录因子，它能指导多种低氧反应基因的转录，对于VEGF的激活有重要意义。信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)信号通路在人类多种肿瘤中持续激活，影响肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润及转移。研究发现内部存在低氧情况的实体肿瘤如Hep-2细胞Stat3的激活与低氧时间存在一定联系，对于细胞的生长、增殖和转移产生重要影响，并可能对HIF-1α的调节具有重要作用。本文应用喉癌Hep-2细胞体外实验检测低氧条件下p-Stat3表达和HIF-1α表达的关系，并进一步检测应用反义寡核苷酸抑制p-Stat3表达对低氧时HIF-1α表达的影响，旨在探明低氧时喉癌Hep-2细胞p-Stat3表达和HIF-1α表达的关系，为靶向Stat3的喉癌基因治疗新策略奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人喉癌细胞系Hep-2购买自中国科学院上海生命科学院，在含有10%新生小牛血清与RPMI 1640培养基中培养。MTT为Sigma公司产品。脂质体LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。全硫代修饰Stat3 AS-ODN和S-ODN由上海生工生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 低氧条件设置 低氧培养实验条件为37℃、5%CO2、2%O2、93%N2，实验在特制的低氧培养箱中进行，具体制作参见参考文献［1］。培养结束后抽取细胞培养液作血气分析(IL1400型血气分析仪，Instrmentation Labrotory，USA)，氧分压为(2.9 ～4.7kPa)，低于常氧对照组氧分压(21.1～21.3kPa)，达到低氧培养要求。

1.2.2 低氧处理 进入对数生长期细胞随机分组为常氧及低氧3、6、12、24h组，按分组时间分别收集细胞，流式细胞技术检测p-Stat3、HIF-1α及VEGF蛋白表达。每组设平行对照3例，实验重复3次。

1.2.3 基因转染及检测 随机分组为空白对照组、脂质体对照组、Stat3 AS-ODN(100、200nmol/L)转染组、Stat3 S-ODN(100、200nmol/L)转染组。实验用Stat3 AS-ODN序列为5’GCT CCA GCA TCT GCT TC 3'全硫代修饰、Stat3S-ODN序列为5'GAA GCA GAT GCT GGA GC 3’全硫代修饰(上海生工生物工程公司合成)。细胞转染过程按转染试剂盒说明书进行。转染后置入常氧培养环境24h后置入低氧环境培养，6h后收集细胞，进行以下实验:①通过MTT法检测细胞存活率。96孔板中每孔加入MTT(5g/L)20μl，继续孵育4h，弃上清，加入甲臜溶解每孔100μL，振荡10min，检测波长570nm的吸光度(OD)值。计算细胞存活率=(实验组OD/对照组OD)×100%。每组设平行对照3例，实验重复3次。②流式细胞技术检测p-Stat3、HIF-1α及VEGF蛋白表达。取1×106/ml细胞悬液1ml加入一抗(单克隆抗体工作液)0.1ml，室温孵育30min，加入 PBS 10ml洗涤 1次，800r/min离心5min，弃上清，加入二抗(FITC-Ig)工作液100μl，避光室温孵育 30min，加入 PBS 10ml洗涤，离心同上。弃上清液除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1ml，经500目铜网过滤后上机检测。采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XLII型流式细胞仪。上机检测得到X-Mode值，样本均道值=340Log(X-mode)，以荧光指数(FI)表示蛋白的相对含量。样本的荧光指数(FI)=实验样本均道值/正常对照样本均道值。每组设平行对照3例，实验重复3次。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0统计学软件对数据处理。计量资料采用单因素方差分析;组间相关性分析使用pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧对Hep-2细胞p-Stat3、HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响及相关性分析

p-Stat3在低氧3h即出现蛋白表达增高，增长至6h后保持稳定(6h组与12、24h组相比差异无统计学意义，P＞0.05)。HIF-1α在低氧3h组与常氧组比较差异无统计学意义(P＞0.05);在低氧6h组与常氧组比较明显增高(P＜0.05);在低氧12h和24h继续增高，与常氧比较差异有统计学意义(P＜0.01)。VEGF在低氧3h和6h组与常氧组比较差异无统计学意义(P＞0.05);在低氧12h和24h组与常氧组比较明显增高(P＜0.01)。见表1。

经 Pearson 相关检验分析，3、6、12、24h各组p-Stat3与对应HIF-1α FI呈直线正相关(r=0.691，P＜0.01);p-Stat3与VEGF FI有明显相关性(r=0.581，P＜0.01);HIF-1α与 VEGF FI呈显著直线正相关(r=0.947，P ＜0.01)。

2.2 Stat3 AS-ODN对低氧条件下Hep-2细胞p-Stat3、HIF-1α、VEGF 蛋白表达的影响

低氧条件下Stat3 AS-ODN转染组、Stat3 S-ODN组、脂质体对照组 p-Stat3 FI分别为0.82±0.03、1.02±0.05、1.00±0.02;HIF-1α FI分别为 0.60±0.13、0.97±0.05、0.96±0.03;VEGF FI分别为0.34±0.22、0.87 ±0.16、0.91 ±0.10。Stat3 AS-ODN 转染组3种蛋白表达与Stat3 S-ODN组和脂质体对照组相比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

经 Pearson’s相关分析 p-Stat3、HIF-1α、VEGF 两两之间均呈直线正相关。(p-Stat3 and HIF-1α r=0.912，P ＜0.01;p-Stat3 and VEGF r=0.790，P ＜0.05;HIF-1α and VEGF r=0.712，P ＜0.05)。

2.3 不同浓度Stat3 AS-ODN转染后Hep-2细胞存活率的变化

不同浓度 Stat3 AS-ODN(100、200nmol/L)转染Hep-2细胞，同时设不同浓度Stat3 S-ODN(100、200nmol/L)转染Hep-2细胞对照和单纯脂质体作用于Hep-2细胞对照，培养24h再置于低氧条件下培养6h，然后检测细胞存活率，结果发现Stat3 ASODN转染各组与脂质体对照组和Stat3 S-ODN对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，而Stat3 SODN转染100、200nmol/L组与脂质体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

表1 低氧不同时间对Hep-2细胞p-Stat3、HIF-1α和VEGF表达的影响()

表1 低氧不同时间对Hep-2细胞p-Stat3、HIF-1α和VEGF表达的影响()

注:＊＊与对照组比较，P＜0.01;*与对照组比较，P＜0.05。

组别 p-Stat3 HIF-1αVEGF对照组1.04±0.03 0.91±0.32 1.00±0.18低氧3h 1.12±0.03* 1.00±0.30 1.06±0.14低氧 6h 1.12±0.03＊＊ 1.87±0.83* 1.08±0.14低氧12h 1.16±0.05＊＊ 3.91±0.67＊＊ 1.71±0.26＊＊低氧 24h 1.12±0.05* 5.04±0.51＊＊ 2.20±0.75＊＊

图1 不同浓度Stat3 AS-ODN转染后Hep-2细胞存活率的变化

3 讨论

随着分子生物学研究技术的进步，基因治疗越来越受到重视。研究热点之一的Stat3是转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription，STATs)的重要成员，广泛表达于不同类型的肿瘤细胞和组织中，介导多种细胞因子和生长因子的信号传导，影响众多靶基因的转录。喉癌等多种实体肿瘤内细胞为乏氧细胞，低氧条件下肿瘤更具有侵袭性，易发生远处转移。Lee等报道在乳腺癌细胞低氧条件也可以作为独立因素刺激Stat3激活［2］。

在我们的实验中发现，喉癌Hep-2细胞低氧3h即出现p-Stat3蛋白表达增强，6h后其表达则基本平稳，6h和12h HIF-1α及VEGF蛋白表达才逐渐出现增高，因此Stat3可能是Hep-2细胞适应低氧的启动步骤，但由低氧诱导的Stat3通路尚不完全明了。除了原有较为明确的705位酪氨酸磷酸化后聚合活化外，727位丝氨酸磷酸化很可能与低氧诱导Stat3激活有着更为密切的关系。在关于乳腺癌的研究中发现低氧条件可以诱导STATs发生不同程度的激活，其中Stat3在人乳腺癌细胞(MCF-7)中的活化与丝氨酸磷酸化的Stat3呈明显的正相关，提示由低氧诱导的磷酸化很可能与Stat3上的727位点上丝氨酸进行磷酸化修饰有关［2］。Stat3的激活很可能在 HIF-1α的降解作用受阻过程中起到了稳定HIF-1α蛋白减少降解的作用，使HIF-1α蛋白在细胞内保持高浓度。Jung等［3］在人肾癌细胞关于低氧的研究中发现HIF-1α C’端577-826位氨基酸是低氧下与p-Stat3结合的位点。另外有研究表明，p-Stat3可以在RNA水平促进肿瘤组织HIF-1α表达［4］。p-Stat3通过 HIF-1α调控VEGF表达，进而影响肿瘤新生血管形成。本研究应用Stat3反义寡核苷酸后，由低氧诱导的p-Stat3、HIF-1α及VEGF表达受到明显抑制。一方面肯定了Stat3反义寡核苷酸对于Stat3信号转导通路高效特异的阻断作用，另一方面也证实了p-Stat3在低氧诱导HIF-1α、VEGF激活过程中必不可少的重要地位。Xu等研究发现小分子Stat3阻断剂阻断Stat3可明显降低肿瘤细胞系DU145及A2058中HIF-1α和VEGF的活化［5］。Gray等在胰腺癌细胞及前列腺癌细胞试验中发现由氯化钴摸拟低氧条件可得到基本相同的结论，低氧下 Src依赖的VEGF的活化受HIF-1α、p-Stat3等的调节［6］。这与我们的实验结论基本相同，在缺少p-Stat3的情况下，Hep-2对于低氧的适应性将有所降低。

总之，Stat3 AS-ODN转染 Hep-2细胞可阻断Stat3通路，抑制肿瘤细胞增殖，同时阻断由于低氧诱导的HIF-1α、VEGF表达，从而降低肿瘤细胞低氧适应性，减少肿瘤血管生成，抑制肿瘤进展。靶向Stat3的干扰技术可成为喉癌基因治疗的新策略，本研究为其临床应用提供了新的实验依据。

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