宗文康 孙保存 孙 涛 董学易 刘艳荣 古 强 赵秀兰

线形程序性坏死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）是近年来发现的一种规律性的Caspases依赖性的肿瘤细胞群体死亡模式，其与血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）、内皮依赖性血管（endothelium-dependent vessels，EV）的形成有关[1-2]。上皮-间充质转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞失去上皮表型转变为具有迁移能力的间充质表型的现象。EMT参与了VM的形成过程[3]。本实验通过构建黑色素瘤小鼠模型，研究在LPPCN和VM形成中，Caspase 8、9对EMT调控蛋白Twist1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 C57BL6小鼠96只，6~8周龄，平均体质量（21.0±1.9）g，购自北京军事医学科学院，清洁实验室饲养，饮用水和饲料均由天津医科大学实验动物中心提供。Cas⁃pase 8抑制剂Z-IETD-FMK和Caspase 9抑制剂Z-LEHD-FM购自SIGMA公司，按照相应剂量分别溶于0.1 mL含10%DMSO的生理盐水中，药物终剂量均为100 μg/kg。兔多抗Twist1抗体和sc-15393均购自Santa Cruz公司，工作浓度为1∶50。

1.2 方法

1.2.1 B16黑色素瘤小鼠模型的建立及分组 将低温保存的B16黑色素瘤组织于43℃的热水中迅速升温20~30 s，然后以1 000 r/min离心10 min，吸取上清液后，剪碎瘤组织，加入生理盐水制成瘤细胞悬液（细胞浓度为2×109/L）。于小鼠蹊部注射瘤细胞悬液0.2 mL/只。待小鼠荷瘤后随机分为Caspase 8抑制剂组（8抑制剂组），Caspase 9抑制剂组（9抑制剂组），Caspase 8、9抑制剂联合用药组（联合组）及对照组,每组24只。

1.2.2 给药方法 （1）8抑制剂组：于小鼠瘤周皮下注射Cas⁃pase 8抑制剂0.1 mL/d。（2）9抑制剂组：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 9抑制剂0.1 mL/d。（3）联合组：于小鼠瘤周皮下注射Caspase 8抑制剂0.1 mL/d和Caspase 9抑制剂0.1 mL/d。（4）对照组：于小鼠瘤周皮下注射含10%DMSO的生理盐水0.1 mL/d。

1.2.3 免疫组织化学染色 断颈法处死小鼠后剖取移植瘤，福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm切片，采……