刘 欢 黄国伟 何 冰 杨 阳 赵 琳

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的未分化细胞[1]。叶酸对于细胞分裂和组织生长具有极其重要的作用。研究证实在胚胎发育早期，补充叶酸能够有效预防神经管畸形（neural tube defects，NTDs），其作用机制可能是叶酸激活神经系统的生长和分化[2]。NSCs是当今研究热点之一，在蛋白质组学中，神经蛋白质组学也被认为是最具潜力的研究热点[3-4]。双向凝胶电泳是根据等电点和分子质量对蛋白质进行分离的方法[5]，是蛋白质组学研究中应用最为广泛的蛋白质分离技术。本研究旨在通过双向电泳（2-DE）方法深入研究叶酸对NSCs增殖分化的作用机制，为探讨叶酸防治神经退行性疾病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级孕Sprague-Dawley（SD）大鼠，14～16 d，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 试剂与仪器 DMEM2429无叶酸培养液、F12培养液、神经细胞培养添加剂B27购于Invitrogen公司；固相pH梯度干胶条（IPG DryStrip，Ph3-10NL）、尿素、硫脲、十二烷基磺酸钠（SDS）、二硫苏糖醇（DTT）、氨基丁三醇（Tris）、3-[（3-胆固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、甲叉双丙烯酰胺、碘乙酰胺、四甲基二乙胺（TEMED）、溴酚蓝、过硫酸胺（APS）、甘氨酸（Glycine）、丙烯酰胺、两性电解质（Bio⁃lyte3-10）、矿物油、等电聚焦仪（Protein IEF cell）、垂直电泳系统（ProteinⅡ xi Cell）、CHemiDOC XRS凝胶成像系统及PD⁃Quest8.0D凝胶图像分析软件均为Bio-Rad公司产品；Benzo⁃nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制剂购于Merck公司；5′-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、甘油、溴酚蓝、低熔点琼脂糖均为Sigma公司产品；人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）为Perotech公司产品；兔抗大鼠巢蛋白（nestin）一抗、小鼠抗大鼠BrdU一抗为Santa Crus公司产品；羊抗兔TRITC荧光二抗、山羊抗小鼠FITC荧光二抗购于北京中杉金桥生物技术公司；银染试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培养和分组 （1）按照文献[6]方法进行NSCs原代培养，取胎鼠脑皮质，剥除脑膜和血管，用培养液冲洗3次，将其剪碎成0.5 mm3，移入DMEM培养液中，吹打数次，制成单细胞悬液，过200目尼龙筛网，1 000 r/min离心10 min，去上清，加入NSCs培养液，即DMEM 2429无叶酸培养液（叶酸浓度为0.6 mg/L）与F12培养液按1∶1混合，含B27添加剂2%，上皮生长因子（EGF）20 μg/L，bFGF 20 μg/L，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素和链霉素100 U/mL，将细胞接种于培养瓶。置37℃、5%CO2培养箱，隔天换液。（2）细胞共分为3组：对照（Control）组叶酸终浓度为4 mg/L；叶酸缺乏（Folate-D）组叶酸浓度为0.6 mg/L；叶酸补充（Folate-L）组叶酸终浓度为8 mg/L。

1.2.2 NSCs的鉴定 增殖第4天，加入终浓度10 mg/L BrdU继续培养24 h，再将NSCs种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板，并加入含有血清的培养基（DMEM，10%胎牛血清），添加B272%，EGF 20 μg/L，bFGF 20 μg/L，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素和链霉素100 U/mL。培养4 h后，Nes⁃tin和BrdU抗体进行细胞免疫组织化学染色[6]，共聚焦显微镜下观察NSCs免疫荧光双标记表达情况。

1.2.3 细胞全蛋白的提取和定量 培养6 d后，收集细胞，加入PBS，1 500 r/min离心10 min，弃上清。重复3次。加入4～5倍体积裂解液，混匀（裂解液成分：7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.2%Bio-Lyte3-10、200 U/mL Benzo⁃nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制剂）。液氮中反复冻融3次，每次3 min。加入200 U核酸酶抑制剂，4℃放置15 min。15 000 r/min，4 ℃离心40 min，收集上清，Bradford法对裂解后NSCs蛋白质样品进行定量。

1.2.4 双向电泳 参考文献[7]，每组样品重复3次。将样品和水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2%Bio-Lyte，痕量溴酚蓝）混合，总体积400 μL（蛋白上样量500 μg），常温被动溶胀上样15 h。等电聚焦程序参数按如下建立：250 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，5 000 V 3 h，10 000 V，至总伏特·小时（V·h）达到80 000。将聚焦后的胶条在SDS平衡液（6 mol/L 尿素，0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，20%甘油，2%SDS）中平衡2次，摇床上振荡15 min，2次，其中第1次平衡液中加入20 mmol/L的DTT，第2次平衡液中加入100 mmol/L碘乙酰胺。将平衡后的IPG胶条进行垂直SDS-PAGE第2相电泳，恒流12 mA 30 min，之后30 mA直至溴酚蓝前沿到达胶底线。所得凝胶参考文献[7]方法进行硝酸银染色。

1.2.5 凝胶图像分析 采用CHemiDOC XRS凝胶成像系统对染色后的2-DE胶进行扫描，PDQuest8.0凝胶图像分析软件进行分析，对同一组标本的3个凝胶图，选取一张点数最多，条纹最少的作为参考胶，与另外2个凝胶图进行匹配，建立该组平均凝胶图，参照平均凝胶图进行蛋白斑点检测，蛋白的相对表达量用扫描积分光密度值表示，2组间表达量升高或降低2倍者定义为差异蛋白点。

2 结果

2.1 NSCs的鉴定 培养2～3 d后，可见大小不等的细胞团，较大的细胞团由数十个细胞组成，细胞边缘发亮，折光性强，呈悬浮状态，即为神经球；随着培养时间的延长，神经球逐渐增大，原代培养至第7天，可形成数百个细胞集落，此时细胞排列紧凑，呈桑葚状。培养的细胞经免疫荧光双标记染色后，于荧光显微镜下观察发现细胞球内的细胞显示红色荧光，细胞核绿色荧光表明BrdU阳性，见图1。

2.2 双向电泳凝胶分离结果 经图像分析，在pH 3～10区域，每块凝胶可分辨874±21（n=3）个蛋白点，软件分析结果见图2，各组凝胶蛋白点匹配率达88.5%，见图3。

图2 蛋白点计数软件图

图3 各组NSC双向电泳凝胶图谱

2.3 差异蛋白分析结果 在pH 3～10的图谱中，Fo⁃late-D组较Control组出现差异蛋白点6个，其中2个蛋白点表达量降低，4个蛋白表达量升高；Folate-L组较Control组出现差异蛋白点3个，其中2个蛋白点表达量降低，1个蛋白表达量升高。

3 讨论

2-DE是蛋白质组学研究中的基础技术，把高分辨率的等电聚焦和SDS-PAGE电泳结合在一起，其分离效果远远高于传统的SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，成为用于复杂蛋白样品分离的首选方法。

NSCs研究已经成为神经科学研究的重要领域。神经系统中多能干细胞的分离、培养成功，不仅对中枢神经系统发育成熟后不可再生理论提出了挑战，而且对于研究脑的发育、分化和中枢神经系统疾病治疗均具有重要意义。本研究在调整了双向电泳中的几个关键因素后，获得了分辨率高、重复性好的NSCs电泳图[7]。

脑损伤后神经元再生的机制复杂，特别是如何控制NSCs定向分化和迁移仍是尚未解决的问题。有研究显示，叶酸缺乏与许多神经系统疾病有关，如阿尔茨海默病、认知损伤等，但与神经退行性疾病之间的关系和机制尚不完全清楚[8]。笔者的前期研究发现，叶酸可促进NSCs的增殖[6]；动物实验显示，叶酸能降低脑缺血大鼠血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平，增强脑缺血大鼠学习记忆能力，改善神经功能[9]。蛋白质组学有助于进一步发现叶酸通过哪些蛋白促进NSCs的增殖分化。由于NSCs样本的获得成本较高，在实验方法上，笔者对NSCs的2-DE条件进行了的摸索，在上样量、等电聚焦条件、样品裂解液、上样缓冲液的成分选择等方面进行了优化，提高了分析的准确性。本研究显示叶酸缺乏和叶酸补充均会影响NSCs的蛋白表达，与Control组比较共发现差异蛋白点9个，这些蛋白可能与NSCs增殖分化有密切关系，其分子质量和等电点等信息通过双向电泳图获得了初步确定，还需要进一步进行质谱鉴定、氨基酸序列分析和数据库的检索以确认为何种蛋白，而这些蛋白在NSCs增殖分化中的具体作用则有待更深入的功能生物学研究。

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