安徽农业大学生命科学学院 崔松松 张 琛＊ 何孔泉 张 洁

生姜蛋白酶是从生姜中提取出的一种植物蛋白酶，作为一种新型植物蛋白酶 （孙国梁等，2007），生姜蛋白酶食用安全，且具有药用保健价值，可用作食品添加剂，如嫩肉剂（吴巧玲，2001）和酒澄清剂、乳制品凝固剂等（唐晓珍等，2002），其应用前景广泛。但是在实际应用中，游离的生姜蛋白酶对环境敏感、稳定性较差，易失活，反应后难以回收（刁恩杰和丁晓雯，2003）。通过对酶的固定化制备，可提高生姜蛋白酶的稳定性，拓展其应用范围。

近年来固定化酶在各学科领域的研究异常活跃，并得到迅速发展和广泛的应用。目前使用和研究中的固定化酶的方法和载体材料种类繁多，其中用海藻酸钠固定化酶的优点是使用方法较为简单，反应条件温和，海藻酸钠还具有无毒、不易被大多数微生物降解的优点（鲁玉侠等，2007；张富新等，2005）；但海藻酸钙凝胶具有不稳定、钙离子易脱落、凝胶变软甚至溶解等缺点，因此为了克服以上缺点（郑婉玲等，1998），本研究选用以戊二醛为交联剂制备海藻酸钠固定化生姜蛋白酶 （王娜等，2009），以期来提高生姜蛋白酶的稳定性，同时为固定化生姜蛋白酶的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及试剂 TD4低速自动平衡离心机，长沙平风仪器仪表有限公司；LXJ-ⅡB低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；KQ-400DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FA2024A电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；752C型紫外分光光度计，南京第四分析仪器有限公司；考马斯亮蓝G-250、酪氨酸、三氯乙酸等均为国产试剂。

1.2 生姜蛋白酶的制备 生姜粉碎后，加入-20℃丙酮，抽干得粉末，再加适量的pH 6.0的磷酸缓冲液提取，离心，取上清液加入单宁使其浓度达0.12%，低温离心，取沉淀物加入缓冲液定容，既为生姜蛋白酶粗酶液（唐晓珍等，2003）。

1.3 固定化酶的制备 取1 mL的溶液酶与2 mL的海藻酸钠于注射器内混匀，然后用注射器将混合液滴入CaCl2溶液中硬化1 h，戊二醛溶液中交联4 h，抽滤，所得的凝胶珠即为固定化酶。

1.4 酶活性的测定 取酶液1 mL，40℃条件下加入底物酪蛋白1 mL，混匀，反应20 min，加入3 mL三氯乙酸终止反应，取上清液在275 nm下测定OD值。固定化酶的酶活测定方法同上。

活力单位定义：一定条件下（pH 6.0，温度为40℃）每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.5 固定化条件的优化

1.5.1 海藻酸钠浓度的影响 戊二醛浓度为1%，CaCl2的浓度为3%，配制浓度为0.5%、1%、2%和3%的海藻酸钠溶液。制备不同浓度海藻酸钠的固定化酶。在275 nm下做酶活测定。

1.5.2 戊二醛浓度的影响 海藻酸钠的浓度为2%，CaCl2的浓度为2%，配制浓度为0.5%、1%、2%、3%和4%戊二醛溶液。制备固定化酶并测其酶活。

1.5.3 CaCl2浓度的影响 海藻酸钠的浓度固定为2%，戊二醛的浓度为1%，配制浓度为1%、2%、3%、4%和5%的CaCl2溶液。制备固定化酶并测定其酶活。

1.5.4 验证试验 海藻酸钠浓度为2%，戊二醛浓度为3%，CaCl2浓度为2%，制备固定化生姜蛋白酶。40℃条件下反应20 min，275 nm下测其酶活。游离酶做同样处理。

1.6 固定化酶的酶学性质

1.6.1 固定化酶和溶液酶最适温度的测定 在优化条件下制备固定化酶，并分别在30、40、50、60、70℃条件下进行反应。溶液酶做同样处理。

1.6.2 固定化酶和溶液酶的最适pH值的测定在优化条件下制备固定化酶，分别在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的缓冲液环境中进行反应。溶液酶做同样处理。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠浓度的影响 载体的浓度影响固定化酶的活性。海藻酸钠浓度过低时载体与酶的固定不完全，易导致酶流失；海藻酸钠浓度过高时海藻酸钠的黏度过大，影响酶与底物反应，从而影响酶活性。根据测得的结果，由图1可知海藻酸钠的最适浓度为2%。

2.2 戊二醛浓度的影响 戊二醛是常用的交联剂，其浓度较低时易导致酶与载体脱落，进而影响酶活性；其浓度过大时易导致戊二醛分子内发生交联而影响酶活性，合适的戊二醛的浓度对固定化酶的活性影响最小，根据图2的结果可知，戊二醛的最适浓度为3%。

图2 戊二醛浓度对固定化酶活性的影响

2.3 CaCl2浓度的影响 CaCl2可与海藻酸钠反应形成海藻酸钙，CaCl2浓度的大小影响凝胶珠的机械强度。根据测得的结果，如图3可知，当CaCl2的浓度为2%时固定化酶酶活性达到最大值。

图3 CaCl2浓度对固定化酶活性的影响

2.4 验证试验 在上述最优条件下，制备固定化生姜蛋白酶，测得固定化酶的酶活为53.48 U/g。

2.5 固定化酶与溶液酶的最适温度 由图4可知，两者的最适温度均为60℃。但固定化酶的相对酶活随着温度的改变，变化较为平缓，在较高温度下，在70℃时保持96.13%的相对酶活，而游离酶其酶活变化幅度较为剧烈。这是因为固定化酶包埋海藻酸钠这一外壳后，对温度的变化没有游离酶敏感，表现出较高的温度稳定性。

图4 游离酶与固定化酶的最适温度

2.6 固定化酶与溶液酶的最适pH 图5表明，固定化酶与溶液酶的最适pH值均为6.0。整个pH值量程中变化中，固定化酶曲线较为平缓，其相对酶活在不同pH值下仍保持80%以上，如pH值为3时固定化酶的相对酶活为80.07%，在pH值为7时酶活仍在93.4%，而游离酶的酶活随着pH值的不同变化较大，在pH值为3时最低，其相对酶活只有37.97%，随着pH值的升高，其酶活变化幅度剧烈，表现出受酸碱影响显著，这是因为载体海藻酸钠的性质不仅对固定化酶的酶活有影响，而且海藻酸钠这一外壳还起保护作用，使酸碱因素对其影响较小，显示出比游离酶更宽泛的适应性。

图5 游离酶与固定化酶的最适pH

3 讨论

生姜蛋白酶是一种较为新型的蛋白酶，但它的稳定性差，并且反应后游离酶和底物、产物难以分离，不利于循环使用，通过对酶固定化可以提高酶的稳定性和利用率。但是，固定化后酶分子由游离态变成固态，由于载体的影响，酶蛋白活性构象会发生变化，使得酶的活性中心受到限制，其次海藻酸钠是甘露糖醛酸以β-1，4糖苷键相连接的多糖类物质，虽然是较为理想的载体，并且固定化方法较为简单，但海藻酸钙凝胶在含多价阴离子溶液以及高浓度电解质溶液中不稳定、钙离子易脱落、凝胶变软甚至溶解，因此通过利用以戊二醛为交联剂的海藻酸钙固定化酶，可使固定化酶在很长一段时间内保持活性而且能较大的提高稳定性能（王秀征等，2009）。本研究利用海藻酸钠和戊二醛对生姜蛋白酶进行双重固定，研究证实，生姜蛋白酶的固定化条件受到多个因素的影响，在海藻酸钠的浓度为2%、戊二醛的浓度为3%、CaCl2的浓度为2%时，制备的固定化酶活力为53.48 U/g，与游离酶相比，固定化酶对温度和酸碱显示出更宽泛的适应性。虽然对固定化生姜蛋白酶的研究取得一定的结果，下一步的工作仍需对固定化的其他条件、固定化酶的稳定性等性质做进一步的探讨，同时探索新的固定化方法，以及应用新的载体，以提高固定化酶的活性回收率，延长其半衰期，从而达到更加理想的使用效果。

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