王会玲 许 烨 张金元

终末期肾功能衰竭(ESRF)和透析患者常并发进行性蛋白质-能量消耗(protein-energy wasting，PEW)，其中骨骼肌消耗(muscle wasting)是导致肾功能衰竭患者虚弱、乏力、生活质量下降的主要原因，也是患者蛋白质-能量性营养不良的主要机制[1]。影响肌肉蛋白质代谢的机制尚不清楚，尿毒症时毒素蓄积、代谢性酸中毒、胰岛素抵抗、微炎症状态等，都可能促进/加速骨骼肌蛋白质分解代谢[2]。文献报道泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)是蛋白质分解的重要执行者，代谢状态下内源性糖皮质激素(glucocorticoids，GC)水平升高，可竞争性拮抗胰岛素受体信号，刺激肌萎缩关键基因表达[3]。我们既往研究显示小鼠慢性肾脏病(CKD)模型的血清GC水平可显著升高10～13倍[4]。本研究通过体外培养肌细胞，研究GC对肌管蛋白质代谢影响及肌肉萎缩蛋白Fbox-1(muscle atrophy F-box,MAFbx,也称为Atrogin-1)的作用机制。

材料和方法

材料与试剂小鼠肌纤维细胞株 C2C12细胞(ATCC A)(晶天生物科技公司)；绿色荧光蛋白病毒载体(SMARTvector Empty vector，Dharmacon)；DMEM培养液(Cellgrov)；胎牛血清(GIBCO)，马血清(Sigma)；液闪计数器(Beckman)；CellLyticTMMT细胞裂解液(Sigma)；RNA提取试剂TRIzol Reagent(invitrogen)；siRNA-Atrogin-1试剂盒(Dharmacon，ON-Target plus SMARTpool，mouse FBx032，Cat#L-049180-00)；Fbx一抗(Everest)；地塞米松(dexmethasone，DEX；American Regent Lab Inc)；荧光倒置显微镜(Olympus 1x70)。

C2C12体外培养及肌管形态观察C2C12细胞以1×106cell/cm2密度接种于6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，细胞达90%密度时，换含2%的马血清DMEM继续培养，3～4d后细胞融合分化形成肌管，加入GFP 2 μl/孔，24h后荧光倒置显微镜观察肌管已着色，用DEX处理细胞，48h后观察肌管形态并拍照，用ImageJ软件(NIH，Frederick，MD)分析。

3H-酪氨酸同位素标记检测肌管蛋白合成和分解蛋白合成采用3H-酪氨酸(3H-Tyrosine)掺入法检测，在细胞分化形成肌管后……