张超贤 郭李柯 郭晓凤

(新乡医学院第一附属医院消化内科，河南 卫辉 453100)

食管癌的发病同多数恶性肿瘤一样，是环境因素与遗传因素共同作用的结果，迄今为止，其确切病因尚不清楚。外来化合物一般不能直接起致癌作用，需经一系列酶系统代谢活化或转化而成为终致癌物后起作用，有的经转化后毒性降低易于排出体外。编码这些酶的某一些基因具有多态性，即具有多个等位基因，不同的等位基因编码的酶活性有差异。代谢酶基因的多态性可使机体清除外源性致癌物的能力有所不同，导致基因的稳定性和细胞的癌变率有所改变，这是决定机体肿瘤易感性的一个重要因素。代谢酶基因多态性与食管癌易感性的研究日渐增多，目前发现的与食管癌易感性相关的代谢酶有细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽转硫酶(GSTs)、乙醛脱氢酶(ALDH)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)等〔1～4〕。为了研究CYP1A1 MspI和ALDH-2在当地人群中的分布状态，进而探索其和饮酒习惯相互作用与食管癌高发的关系，本研究在国内首次开展了CYP1A1 MspI和ALDH-2联合基因多态性与食管癌易感性关系的研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2005年3月～2007年4月在我院收治的食管癌患者160例，年龄(54.38±6.92)岁，病理学确诊均为原发性食管鳞癌或腺癌。对照组160例为健康体检人群，年龄(53.85±3.42)岁，体检显示无肿瘤及遗传性疾病，两组在年龄、性别、民族、籍贯统计学处理差异无显著性，无血缘关系，调查收集研究对象的人口学资料、吸烟史、职业史和家族肿瘤史。饮酒状况由饮酒指数(DI)来估计，DI表示每日饮酒两数×饮酒年数，本文分为不饮酒、DI≤60者和DI＞60者。每人各抽取静脉血2～3 ml，置EDTA抗凝管，分离白细胞层。用QIAamp-DNA提取试剂盒(德国QIAgen公司)提取白细胞DNA，DNA置－30℃低温冰箱保存备用。两组临床资料见表1。

1.2 基因测定

1.2.1 CYP1A1 MspI多态性分析 引物序列5-CAG TGA AGA GGTGTA GCCGCT-3和5-TAG GAG TCT TGT CTCATGCCT-3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系总量 25μl，包括 10×缓冲液 2.5μl、1 mmol/L dNTP 2.5 μl、引物各15 pmol、TaqDNA 聚合酶2.5 U、模板 DNA 2 μl，以上试剂购自美国 Promega公司。扩增参数:94℃预变性4 min，94℃变性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，于美国 PE公司PE480 PCR仪中循环35次后，72℃延伸7 min。取PCR扩增产物5μl于1.5%琼脂糖凝胶中，100 V电泳1 h，EB染色30 min，紫外分析仪观察PCR扩增结果。电泳板琼脂糖由大连宝生物工程有限公司生产。取PCR产物10μl，加入MspI内切酶(大连宝生物公司)，酶切反应体系总量30μl，包括PCR产物 10 μl、10 × 反应缓冲液2 μl、MspI内切酶10 U，37℃ 3 h。酶切后产物点样于1.5%琼脂糖凝胶中，100 V电泳1 h，EB染色30 min，分析结果。酶切后分为3种基因型:野生型A(m1/m1)为 340 bp，杂合型 B(m1/m2)为 340、200、140 bp，突变纯合型 C(m2/m2)为 200、140 bp。见图 1。

1.2.2 ALDH-2多态性分析 采用PCR-RFLP引物序列〔2〕:Y3∶5'-CCCTTTGGTGGCTAGAAGATG-3'，Y4∶5-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3'。扩增片段为 91 bp。PCR扩增体系为25 μl，内含 1 μl DNA，1 μmol/L 引物，0.25 mmol/L4 × dNTP，0.25 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶(购自宝生生物工程有限公司)，以及2.5μl 10×缓冲液。扩增条件为:95℃预变性10 min，然后进行 35 个循环(95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃1 min)，最后72℃延伸5 min。扩增后取PCR产物3μl，加入5UMboⅡ限制性内切酶(购自宝生生物工程有限公司)及与内切酶相配套使用的10×缓冲液，总量为10μl，37℃消化2.5 h。酶切产物的电泳分离与结果判断。取酶切产物8μl，作15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，紫外灯照射，观察结果。谷氨酸纯合型ALDH12(G/G)-55 bp;谷氨酸赖氨酸杂合型 ALDH1＊22(G/L)-65 bp，55 bp;赖氨酸纯合型ALDH22(L/L)-65 bp。见图2。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件包进行χ2检验和Logistic回归分析。

2 结果

2.1 CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型分布情况及两者与食管癌易感性的协同分析 食管癌组与对照组CYP1A1 MspI(m2/m2)差异有显著(P＜0.01)，食管癌组与对照组ALDH2(Non-G/G)差异亦有显著性(P＜0.01);两者协同分析显示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH2(Non-G/G)在食管癌组占31.875%，而对照组仅占6.250%，基因组合CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)的食管癌患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH-2(G/G)的9.909倍，两个基因型之间存在协同作用。见表 2，表 3。

2.2 食管癌的易感性与饮酒的相关分析 将正常对照组的饮酒人数和不饮酒人数与食管癌组的饮酒人数和不饮酒人数进行χ2检验，结果表明食管癌的发生与饮酒有关，饮酒者容易患食管癌(OR=3.096，95%CI=1.532 ～4.880，P ＜0.01);食管癌易感性与饮酒指数相关分析显示，高饮酒组较低饮酒组更易患食管癌(OR=6.131，95%CI=3.964～8.315，P ＜0.01)。见表 4，表 5。

2.3 CYP1A1 MspI和ALDH-2基因型和饮酒与食管癌易感性的协同分析 食管癌组中携带CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)和饮酒者明显较对照组多，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)吸烟者占食管癌组的30.000%，而在对照组中仅1.875%，有显著性差异(P＜0.01);饮酒指数与CYP1A1 MspI/ALDH-2和食管癌易感性的协同分析显示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)/DI＞60组合的患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH2(G/G)/SI≤60组合的352.500倍。见表6，表7。

表1 食管癌组和对照组的一般资料〔n(%)，n=160〕

表2 两组CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型多态性分布〔n(%)，n=160〕

表3 CYP1A1 Msp I和ALDH-2基因型与食管癌易感性的协同分析〔n(%)〕

表4 食管癌易感性与饮酒的相关性分析〔n(%)，n=160〕

表5 食管癌易感性与DI相关分析〔n(%)，n=160〕

表6 CYP2E1-RsaI/ALDH 2基因型和饮酒与食管癌易感性的协同分析〔n(%)，n=160〕

图1 CYP1A1 PCR产物MspI酶切电泳

图2 ALDH-2基因PCR产物检测

表7 CYP2E1-RsaI/ALDH-2基因型和DI与食管癌易感性的协同分析〔n(%)，n=160〕

3 讨论

酒精不是一种致癌剂，而酒精的代谢产物——乙醛却具有明显的致癌作用。研究发现，乙醛是一种肯定性的致癌剂，它与人类肿瘤的发生存在着一定的关系〔5〕。乙醛脱氢酶(ALDs)是人体内代谢酒精的酶。ALDH-2是由ALDH-2基因编码，该基因在染色体上的位置为:12q24，由13个外显子构成，编码的酶蛋白肽链由500个氨基酸残基组成。ALDH-2基因有二个等位基因，把具有催化活性的野生型称为:ALDH12，催化能力失活的变异型称为:ALDH22。由于遗传，在人群中该酶基因型出现3种情况，具有正常催化活性纯合子型。ALDH1＊12(G/G);催化活性下降的杂合子型:ALDH1＊22(G/L);催化活性失去的纯合子型ALDH2＊22(L/L)。后两种基因型可引起相应的ALDH-2表达缺失或活性降低，导致机体乙醛的集聚，从而增加特定肿瘤发病率，国内外研究证明ALDH-2基因多态性与多种肿瘤风险相关〔5，6〕。

大多数环境致癌物在体内都需要代谢激活后才有致癌性，乙醛同样需要经过体内I相代谢酶的活化，CYP1A1是重要的I相代谢酶之一，CYP1A1可催化乙醛等外来化合物进人体内的I相氧化反应，把无活性的前致癌物激活转变为亲电子化合物，该亲电子化合物可攻击细胞内的生物大分子，与DNA或蛋白质形成加合物，最终引起癌基因和抑癌基因的改变，从而导致癌变。CYP1A1基因定位于人类染色体15q 22224，包含7个外显子和6个内含子。CYP1A1的表达受基因的控制和环境因素的诱导其本底表达和诱导表达水平均有显著的个体差异。其3'端非翻译区的 T6235C置换产生一个 MspⅠ酶切位点即MspⅠ多态性，突变基因的存在可能是通过与该基因调节区其他多态性的连锁而影响CYP1A 1的诱导性。已有研究报道认为Msp I位点的多态性与喉癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的易感性有关〔7，8〕。本研究与上述研究结果一致。CYP1A 1(m2/m2)基因型者易患食管癌的机制还不清楚，相关研究均明m2基因型的酶活性高于m1基因型。因此，m2/m2纯合子易患食管癌的原因可能是此种基因型者体内CYP1A 1活性高，可产生更多的活性致癌物〔9〕。

本研究发现ALDH-2(Non-G/G)与食管癌的发生有关，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，ALDH-2(Non-G/G)与CYP1A 1(m2/m2)对食管癌的发生有显著的协同作用，兼有ALDH-2(Non-G/G)与CYP1A 1(m2/m2)型者食管癌发生率是兼有ALDH-2(G/G)和CYP1A 1(Non-m2/m2)型食管癌发生率的9.909倍。此外，本研究发现饮酒与食管癌的易感性有关(OR=3.096，95%CI=1.532～4.880，P ＜0.01)。对 CYP1A 1-MspI和ALDH-2基因型与饮酒关系的协同分析发现，在食管癌患者中携带CYP1A 1(m2/m2)型基因且饮酒、ALDH-2(Non-G/G)基因型人较对照组多，经统计学检验差异有显著性(P＜0.01)。CYP1A 1(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)型饮酒者发生食管癌的危险显著增加(OR=40.727，95%CI=17.965～66.572)，通过对吸烟状况分析，发现大量饮酒者(DI＞60)且具有ALDH-2(Non-G/G)与CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的相对危险度大(OR=352.500，95%CI=229.833～463.317)，对于DI≤60者，ALDH-2(Non-G/G)/CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的风险(OR值)为3.750，可以看出，饮酒量越大，时间越长，食管癌患病风险越大。

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2 Butler WJ，Ryan P，Robers-Thomson IC.Metabolic genotypes and risk for colorectal cancer〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2001;16(6):631-5.

3 Song C，Xing D，Tan W，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms increase risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population〔J〕.Cancer Res，2001;61(8):3272-5.

4 Yokoyama A，Muramatsu T，Ohmori T，et al.Alcohol and aldehyde dehydrogenase gene polymorphisms and oropharyngolaryngeal，esophageal and stomach cancers in Japanese alcoholics〔J〕.Carcinogenesis，2001;22:433-9.

5 丁建华，吴建中，高长明，等.乙醛脱氢酶2基因多态性和饮酒习惯与肝癌的易感性〔J〕.肿瘤，2004;24(4):309-12.

6 Matsuo K，Hamajima N，Shinoda M，et al.Gene-environment interaction between an aldehyde dehydrgenase-2(ALDH2)polymorphism and alcohol consumption for the risk of esophageal cancer〔J〕.Carcinogenesis，2001;22(6):913-6.

7 Seremak-Mrozikiewica A，Drews K，Semczuk A，et al.CYP 1A1 alleles in female genital cancers in the Polish population〔J〕.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2005;118(2):246-50.

8 Taylor R T，Wang F，Hsu EL，et al.Roles of coactivator proteins in dioxin induction of CYP 1A1 and CYP 1B1 in human breast cancer cells〔J〕.Toxicol Sci，2009;107(1):1-8.

9 沈海幸，付 颖，袁 杨，等.细胞色素P4501A1基因多态性与胃癌易感性的研究〔J〕.大连医科大学学报，2005;27(1):22-4，67.