向 莉，李书剑 ，张杰文

河南省人民医院神经内科郑州450003

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins，PAP)是在美洲商陆的不同组织或不同生长阶段合成的一类具有酶功能的核糖体单链失活蛋白。该蛋白属于Ⅰ型核糖体失活蛋白［1］，具有RNA N-糖苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特殊位点上切下一腺嘌呤，使其难以与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合，从而阻碍蛋白质的合成［2-3］。最新研究［4-5］表明，PAP 不但能够对7个植物病毒属的成员具有抑制作用而且对真菌、细菌及人类免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定的抑制效果。作者检测了PAP对人神经胶质瘤细胞U251生长细胞周期分布及凋亡的影响，为进一步揭示PAP蛋白抑制肿瘤作用的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 PAP基因的克隆、重组及表达纯化由郑州大学公共卫生学院毒理学教研室完成。人神经胶质瘤细胞U251由郑州大学公共卫生学院毒理学教研室传代并保存。Taq DNA聚合酶购自北京鼎国公司。限制性内切酶、DNA Marker、dNTP、克隆载体pMD19-T Vector等购自 Takara公司。胎牛血清、RPMI 1640、2.5 g/L胰蛋白酶购自 Hyclone公司，MTT为Sigma公司产品。

1.2 MTT法检测PAP对U251细胞生长的影响将U251细胞以每孔2×105个接种于96孔板中，培养 24 h 后换用含不同浓度 PAP(0、20、40、60、80和100 mg/L，处理48 h，实验结束前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL继续培养4 h，去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，振荡 10 min;上酶联免疫检测仪，于波长492 nm处测每孔的吸光度(A)值。另取40 mg/L PAP处理U251细胞24、36、48和72 h，同上测定波长492 nm处的A值。细胞生长抑制率 =(1－A处理样品/A对照样品)×100%。每组设3个复孔。

1.3 流式细胞仪检测各周期细胞百分比 在细胞培养板中每孔接种2×105个细胞，同时加入含40 mg/L PAP的培养液，在体积分数5%CO2培养箱中于37℃培养36 h(处理组)。……