向 莉，李书剑 ，张杰文

河南省人民医院神经内科郑州450003

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins，PAP)是在美洲商陆的不同组织或不同生长阶段合成的一类具有酶功能的核糖体单链失活蛋白。该蛋白属于Ⅰ型核糖体失活蛋白［1］，具有RNA N-糖苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特殊位点上切下一腺嘌呤，使其难以与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合，从而阻碍蛋白质的合成［2-3］。最新研究［4-5］表明，PAP 不但能够对7个植物病毒属的成员具有抑制作用而且对真菌、细菌及人类免疫缺陷型病毒(HIV)等都具有一定的抑制效果。作者检测了PAP对人神经胶质瘤细胞U251生长细胞周期分布及凋亡的影响，为进一步揭示PAP蛋白抑制肿瘤作用的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 PAP基因的克隆、重组及表达纯化由郑州大学公共卫生学院毒理学教研室完成。人神经胶质瘤细胞U251由郑州大学公共卫生学院毒理学教研室传代并保存。Taq DNA聚合酶购自北京鼎国公司。限制性内切酶、DNA Marker、dNTP、克隆载体pMD19-T Vector等购自 Takara公司。胎牛血清、RPMI 1640、2.5 g/L胰蛋白酶购自 Hyclone公司，MTT为Sigma公司产品。

1.2 MTT法检测PAP对U251细胞生长的影响将U251细胞以每孔2×105个接种于96孔板中，培养 24 h 后换用含不同浓度 PAP(0、20、40、60、80和100 mg/L，处理48 h，实验结束前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL继续培养4 h，去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，振荡 10 min;上酶联免疫检测仪，于波长492 nm处测每孔的吸光度(A)值。另取40 mg/L PAP处理U251细胞24、36、48和72 h，同上测定波长492 nm处的A值。细胞生长抑制率 =(1－A处理样品/A对照样品)×100%。每组设3个复孔。

1.3 流式细胞仪检测各周期细胞百分比 在细胞培养板中每孔接种2×105个细胞，同时加入含40 mg/L PAP的培养液，在体积分数5%CO2培养箱中于37℃培养36 h(处理组)。以不加药物的样品孔为正常对照(对照组)。细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化并吹打成单细胞悬液。室温500 g离心5 min收集细胞，用PBS洗涤细胞1次。细胞沉淀用体积分数70%乙醇(冰预冷)4℃固定24 h。离心去乙醇，用1 mL PBS重悬细胞后，过400目网筛，500 g离心5 min收集细胞。用0.2 mL PI染液悬浮细胞，4℃避光染色30 min，用流式细胞仪进行细胞计数与分析。细胞周期分析使用Pheonix公司的Multicycle软件。

1.4 凋亡细胞观察 40 mg/L PAP处理U251细胞36 h后，Hoechst33258染色，采用荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态，并计算凋亡细胞百分比。

1.5 Northern blot检测FasL和Fas基因的表达取对数生长期的U251细胞分别以5×105个/瓶的密度接种于75 mL培养瓶，加入10 mL 0或40 mg/L PAP处理液，收集处理24、48、72和96 h的细胞，提取细胞总RNA，－70℃保存。比较42℃预杂交4 h，用［32P］dCTP 标记 FasL 和 Fas基因 cDNA 探针后42℃杂交20 h，洗膜后用X光片压片3～7 d。β-actin作为内参。实验重复3次。

1.6 Western blot检测FasL和Fas蛋白的表达将培养后的细胞用PBS冲洗，加入细胞裂解液提取细胞蛋白，离心收集上清液，用试剂盒测定蛋白浓度。每份样品取40 μg进行120 g/L SDS-PAGE分析，湿式转移法转至膜，50 g/L脱脂奶粉封闭，加入一抗，4℃振荡过夜，加入羊抗兔IgM作用2 h，采用化学发光法进行信号检测。实验重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析。应用单因素方差分析比较不同浓度或不同时间处理后U251细胞生长抑制率有无差异，两两比较用LSD-t检验，对照组和处理组细胞凋亡率比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PAP对U251细胞生长的抑制作用 见表1和表2。

表1 不同浓度PAP处理48 h对U251细胞生长的抑制作用 %

表2 40 mg/L PAP处理不同时间对U251细胞生长的抑制作用 %

2.2 对照组和处理组各周期细胞百分比 见表3。

2.3 2组细胞凋亡情况 凋亡细胞皱缩，核密度增高，核断裂，可见凋亡小体，细胞染色质呈浓染的块状或颗粒状荧光，聚集于核周边或裂解成碎片，见图1。处理组细胞凋亡率(5.78±0.35)%高于对照组的(18.63 ±1.26)%(t=106.350，P=0.007)。

表3 对照组和处理组各周期细胞百分比 %

图1 U251凋亡细胞核形态观察(Hoechst33258，×100)

2.4 Northern blot和 Western blot检测 U251 凋亡相关基因和蛋白的表达 Northern blot检测结果显示，40 mg/L的PAP处理后，随处理时间的增加，Fas基因的表达受抑而FasL基因的表达上调(图2A)。Western blot结果显示，40 mg/L PAP处理后，随着处理时间的增加，Fas蛋白的表达下降，FasL蛋白而有所增加(图2B)。

图2 FasL和Fas mRNA基因(A)和蛋白(B)的表达

3 讨论

肿瘤细胞的凋亡是决定肿瘤生长快慢的主要因素之一。诱导肿瘤细胞凋亡是许多中、西药抑制肿瘤机制之一。增强肿瘤细胞凋亡来促进其自然消退是治疗肿瘤最有效的治疗方法。

该研究发现PAP在体外20～100 mg/L浓度范围内均能抑制U251细胞生长，且随作用浓度增加，抑制作用增强，同时该研究还提示40 mg/L的PAP作用U251细胞后，随作用时间增加，抑制作用增强。PAP处理U251细胞36 h可见典型的凋亡细胞形态学改变。流式细胞仪检测结果也表明药物PAP能诱导U251细胞凋亡，并且G0+G1期的U251细胞明显增多，说明 PAP可以将U251细胞阻滞于G0+G1期。该实验结果表明，PAP对人神经胶质瘤细胞株U251体外增殖具有明显抑制作用，可能是通过诱导U251细胞凋亡实现的。研究［6-7］发现PAP能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、提示其在抗肿瘤方面具有广阔的应用前景。

该研究Northern blot和Western blot检测结果显示，PAP可抑制U251细胞Fas基因和蛋白的表达，上调FasL基因和蛋白的表达。Fas抗原及其配基(FasL)分别隶属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和TNF超家族成员。由Fas与FasL结合启动的凋亡信号传导是最终导致细胞凋亡和(或)细胞毒效应的重要途径。因此，对Fas/FasL途径的深入研究可为通过诱导细胞凋亡而治疗恶性肿瘤提供新的凋亡激发环节。

以上结果表明PAP蛋白能抑制U251细胞增殖，诱导人U251细胞发生凋亡，为PAP蛋白的开发和临床应用提供了有力的依据。

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