巢玉柳 金永 卞敏凯 张亮 蒋纯志

椎间盘退变是临床的常见病。本实验拟将兔骨髓间充质干细胞 （Bone Mesenchymal stem cells，BMSC）结合藻酸盐凝胶，治疗兔椎间盘退变，观察其可行性和治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

新西兰大白兔 （南京医科大学动物中心），3月龄，1～1.8 Kg， 雌雄不限；DMEM 培养基 （Gibco公司）；胎牛血清（天津市北辰盛达生物制品厂）；藻酸盐（Sigma公司）；鼠抗人Ⅱ型胶原抗体以及 Elivision plus免疫组化试剂盒（迈新公司）；硫酸软骨素、木瓜蛋白酶（Sigma公司）；二甲基亚甲蓝（Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 移植物的制备

1.2.1.1 BMSC的培养和鉴定

实验兔以3%戊巴比妥（1 mL/Kg）耳缘静脉麻醉，股骨抽取骨髓约3 mL，FICOLL淋巴细胞分层液密度梯度离心，取中层单细胞悬液，加入DMEM培养液，贴壁法分离、培养BMSC。接种后5 d首次换液，以后每3天换液，约2周后细胞基本铺满单层后传代。倒置相差显微镜观察，贴壁的BMSC细胞呈长梭形，旋涡状排列，形成集落。

1.2.1.2 藻酸盐凝胶制备和体外BMSC复合体构建

将藻酸钠用三蒸水制成1.2%溶液，高温高压消毒备用。准备无菌100 mL氯化钙溶液。将已备好的BMSC悬液以1×106cells/mL浓度与藻酸钠混匀后缓慢滴入氯化钙溶液，可形成均匀的凝胶，吸取多余氯化钙溶液，加入DMEM培养液。2 d后换液，镜下观察三维支架内的细胞生长良好，切片，HE染色。

1.2.2 动物模型制备及实验分组

1.2.2.1 动物模型制备

取15只健康新西兰大白兔，麻醉，取腹部后外侧纵行切口，经腹膜外入路钝性分离腰肌到达椎体侧方，必要时破坏横突，暴露 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6椎间隙，16号注射器针头刺入椎间隙5 mm，反复穿刺10次，并抽吸髓核组织。术后一天禁食，抗炎、补液。……