蒋永康 何晶 李洁 曹谊林 刘伟

组织工程化肌腱为修复肌腱缺损提供了良好的前景[1]。由于肌腱缺乏特异的分子标志，肌腱发育生物学的研究进展缓慢，极大地限制了组织工程化肌腱研究的进展。近来研究发现，Tenomodulin（TNMD）是肌腱相对特异的分子标志，在肌腱发育成熟中起着重要作用[2－3]。研究表明，TNMD基因敲除小鼠的肌腱细胞增殖明显减弱，细胞密度降低；胶原纤维直径相互之间差异增大，出现直径明显粗大的纤维[4]。因此，推测TNMD可能影响肌腱相关基因的表达，而目前未见此方面研究报道。本实验通过在NIH3T3和C3H10T1/2细胞系中过表达TNMD，定量PCR检测肌腱相关基因的表达情况，从而对TNMD在肌腱发育成熟中的作用有所了解，为组织工程肌腱的构建提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养液（Gibco公司，美国），胎牛血清（Hyclone公司，美国），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国），质粒小抽提试剂盒（Qiagen公司，德国），Fugene HD Transfection Reagent（Roche 公司，瑞士），PCR试剂盒（Takara公司，日本），定量PCR试剂盒（SYBR Green，Applied Biosystems公司，美国），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），定量PCR荧光探测仪（Stratagene 公司，美国）。

1.2 细胞培养

分别将液氮中冻存的NIH3T3细胞系 （本实验室细胞库）和C3H10T1/2细胞系（中科院上海生物化学和细胞生物学研究所丁小燕实验室惠赠）快速复苏，用含10%胎牛血清和100 μg/mL青、链霉素的DMEM培养液重悬，以1×105个细胞/皿接种于10 cm培养皿中，第二天换液去除死细胞。以后每隔2 d换液，待细胞增殖达到80%～90%融合时传代培养。

1.3 pCAGGS空载体和pCAGGS-TNMD表达载体准备

pCAGGS-TNMD表达载体由日本京都大学再生医科学研究所Hiraki实验室惠赠。常规转化DH5α大肠杆菌，过夜摇菌，质粒小抽提，酶切鉴定从而得到足够数量的pCAGGS-TNMD表达载体。……