李芳秋,周万青,王立魁,史利宁,邵海枫

(南京军区南京总医院·解放军临床检验医学研究所,江苏南京210002)

曲霉菌属已成为免疫功能低下患者致命性感染的重要致病因子。其易感人群包括中性粒细胞减少症、同种异体造血干细胞移植或肺移植、HIV感染晚期以及遗传性免疫缺陷症患者。侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的确诊或临床诊断需要病原学依据,由于血培养阳性率极低,曲霉特异性诊断标志缺乏,使得病原学诊断困难,阻碍着及时、有效的治疗[1]。扩增曲霉特异性基因(通常为编码核糖体RNA的基因)的PCR诊断方法,已经在侵袭性曲霉病的诊断中显示出良好的应用前景[2、3]。本实验将利用烟曲霉播散性感染动物模型,取不同感染时段外周血分别进行PCR测定和曲霉培养,考查巢式PCR对侵袭性曲霉感染的早期诊断的可行性。还检测了25例临床患者外周血中烟曲霉基因,并与GM试验结果比较,评价巢式PCR方法在IA诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1主要试剂及仪器Taq DNA聚合酶及dNTPs(Promega公司),蛋白酶K(Merck公司),E.Z.N.A.Fung DNA Kit(Omega公司),100bp DNA Marker(Fermentas公司);PlateliaTM Aspergillus EIA GM Kit(Bio-Rad公司);PCR扩增仪及紫外分光光度计(Eppendorf公司),凝胶成像分析系统(捷达公司)。

1.2实验动物及主要药物新西兰白兔由南京军区南京总医院实验动物中心提供,体重2.5-3.5 Kg,雌性,1只/笼,常规饲养。注射用氢化可的松,天津金耀氨基酸有限公司,批号:0710312;注射用头孢他啶,广州白云山天心制药股份有限公司,批号:080801。

1.3菌株及分生孢子的制备烟曲霉(A1株,由中科院皮肤病研究所馈赠)接种SDA斜面培养基,28℃培养4天,用含0.5%Tween-20的生理盐水冲洗菌落获得分生孢子,并在旋涡振荡器上剧烈振荡使成单个孢子,离心收集上清中单个孢子悬液。……