李 莉,赵焕英,杨川杰,鲁苇媛,郝 淳,乔 茶,周平坤,徐勤芝,丁库克*

(1.首都医科大学附属北京佑安医院,北京100069,2.首都医科大学,北京100069;3.河北医科大学附属第二医院,河北 石家庄050000;4.军事医学科学院放射毒理研究室,北京100850)

IER5(Immediate early response 5)基因位于人的1号染色体上1q25.3[1],属于早期慢反应基因家族中的一员。其对细胞有丝分裂-细胞周期的调节和细胞凋亡可能发挥重要作用[2-4]。但至今对该基因辐射效应的作用机理及其生物学功能尚不清楚[5,6]。因此,为了进一步研究IER5基因的生物学功能与它在宫颈癌放疗上的潜在应用,我们利用RNA干扰技术,构建并筛选出IER5-siRNA质粒,建立IER5基因表达抑制的细胞系,以利于开展今后有关的基因功能研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株和质粒

人宫颈癌细胞系(Hela)由本实验室保存,siRNA表达质粒载体PsilencerTM 3.1-H1 hygro购于Ambion公司。DH5α感受态细胞购自博大泰克公司产品。

1.2 主要试剂

T4 DNA连接酶购自Promega公司,质粒提取试剂盒为vigrous公司产品,Hind III和BamH I为NEB公司产品,DMEM和Lipofectamine为GIBCO BRL公司产品,潮霉素(Hygromycin)B为Roche公司产品。Trizol试剂和反转录扩增试剂盒为Invitrogen公司产品。IER5鼠抗人多克隆抗体购自台湾Abnova公司、Ecl显色液购自 Perkinelmer公司、Ecl Anti-Mouse IgG and Anti-Rabbit IgG(二抗)购自Sigma公司等。

1.3 筛选编码IER5基因的siRNA的DNA序列

通过检索NCBI GeneBank得到IER5基因RNA全序列,选择其编码区(CDS)作为siRNA设计的靶序列。利用Ambion公司提供的在线设计工具,进行初步设计与筛选,找出具有siRNA功能的可能靶序列及其对应编码siRNA的DNA序列。

1.4 构建带有编码特异性沉默IER5基因的siRNA的DNA载体

将上述1.3中设计的编码siRNA的DNA序列送到Invitrogen公司合成。将DH5α感受态与上述目的DNA混合,借助于具有抗生素的LB琼脂培养板进行培养,通过挑菌、摇菌与提取质粒DNA(按照试剂盒说明进行操作),得到连接有 siRNA的 PsilencerTM 3.1-H1 hygro载体质粒。……