兔抗猪血凝性脑脊髓炎高免血清及IgG的制备

2011-06-12常灵竹苗丽娟

饲料博览 2011年12期

常灵竹，苗丽娟

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。临床上以仔猪呕吐、衰竭或明显的神经症状为主要特征[1]。主要侵害3周龄以下的乳猪，病程约10日，被感染仔猪的发病率和致死率都可达100%，成年猪呈隐性感染。该病目前尚无特效疗法和有效疫苗，多数流行地区处于呼吸道亚临床感染状态。母源抗体可保护仔猪不受该HEV的侵害。未获得母源抗体的仔猪，可在初生后注射高免血清建立被动免疫[2-7]。诊断和治疗用血清所含的抗体主要为IgG，而IgG在疾病诊断治疗方面的应用越来越广泛，制备高纯度的抗体显得尤为重要。本试验拟利用家兔制备抗猪血凝性脑脊髓炎的高免血清，并利用高免血清制备和提纯IgG。

1 材料与方法

1.1 试验动物

家兔购自吉林大学实验动物中心。

1.2 细胞和病毒

HEV和猪肾细胞（PK-15细胞）由吉林大学病理实验室提供。

1.3 HEV的培养与纯化

采用单层吸附接毒法繁殖HEV，用10%的MEM培养PK-15传代，待细胞长成单层后，倾弃营养液，加入HEV，37℃吸附1 h，然后加入2%维持液，置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞出现＞80%的病变时，将细胞培养瓶放入冰箱中，经反复冻融2～3次后，将细胞液集合在同一个固定的容器中，置于-20℃保存备用[8]。最后将大量收取的病毒液溶化，将病毒液放入到无菌的离心管中，6000 rpm、4℃离心30 min，取上清，再用20000 rpm、4℃离心3 h，收集病毒沉淀，用TNE溶解，用0.22 μm滤膜过滤，保存于-80℃备用。测定纯化后HEV感染力的滴度，根据Reed-Muench方法计算HEV的TCID50[9]。

1.4 兔抗HEV阳性血清的制备

猪血凝性脑脊髓炎病毒细胞培养物经纯化后，56℃灭活30 min，灭活后的病毒对家兔进行3次免疫，首次加入弗氏完全佐剂，以后两次加入弗氏不完全佐剂，佐剂与病毒的比例为1∶1。免疫2只家兔，每只500 μL·次-1（103.4TCID50·100 μL-1），每次间隔14 d，用ELISA方法鉴定血清是否为阳性[10]。

1.5 抗体的亲和层析纯化

1.5.1 饱和硫酸铵粗提IgG

在血清中先加入等体积的PBS，搅拌混合均匀，再缓慢滴加相同体积的饱和硫酸铵，边滴加边搅拌，完全混匀后，室温静置1 h（或4℃过夜），10000 rpm离心10 min，收集沉淀，用少量的PBS溶解沉淀，然后装入透析袋内，置于20倍体积的PBS（pH 8.0）中，4 ℃ 透析2 d，每天换液2次[11]。收集脱盐后的抗体溶液，用0.22 μm滤膜过滤，备用。

1.5.2 蛋白A亲和层析纯化IgG

首先将蠕动泵、收集器、核酸蛋白测定仪与层析柱相连；用0.1M pH 8.0的磷酸缓冲液平衡柱床；然后加入经饱和硫酸铵粗提的IgG，室温作用15 min，用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值＜0.02。用醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG，收集3 mL于离心管中，应用LM17型记录仪记录检测。先用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液平衡柱床，再用20%的乙醇平衡柱床。将收集的液体装入透析袋内，置于PBS溶液中，4℃透析过夜。次日将透析袋取出，10000 rpm离心15 min，收集上清，用ELISA方法检测血清抗体效价，保存备用。

分别取血清和纯化后的IgG 0.01 mL作为样品，分别加入2倍SDS上样缓冲液与样本1∶1混合，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳，凝胶染色-脱色后，根据血清和纯化后的IgG的蛋白含量，判断其纯化效果[12]。

2 试验结果

2.1 TCID50测定结果

根据Reed-Muench方法计算HEV的TCID50，结果纯化后HEV的滴度为103.4TCID50100 μL-1。

2.2 兔抗HEV高免血清的效价

在第3次免疫后第7 d采血，用ELISA方法测定兔抗HEV血清效价，效价测定结果为1∶12800，符合试验要求，采血并分离血清。

2.3 IgG的纯化结果和效价

经过亲和层析纯化得到的兔抗HEV IgG，根据电泳结果可明显看到两条带，一条为IgG的重链，另一条为IgG的轻链，见附图。用ELISA方法测定兔抗HEV IgG的效价为1∶50000。

3 讨论

试验用ELISA方法测定兔抗HEV血清效价，测定结果表明，所制备的血清效价较高，可达1∶12800；根据SDS-PAGE电泳结果可明显看到两条带，一条为IgG的重链，另一条为IgG的轻链，没有其他杂带，说明使用亲和层析得到较高纯度的IgG，经ELISA方法测定兔抗HEV IgG的效价高达1∶50000，比未纯化前的血清效价提高390%。IgG主要是由浆细胞产生的，是哺乳动物血清中主要的免疫球蛋白，约占血清免疫球蛋白总量的75%。IgG在血液中含量高，维持时间长，对构成机体的免疫力起着重要作用；当体内缺乏IgG时，常易患化脓性感染，导致病原微生物经血流扩散。诊断和治疗用血清所含的抗体也主要为IgG，因此制备高纯度的抗体显得尤为重要。要提纯IgG必须利用化学方法从血清中除去血清白蛋白，沉淀出血清γ球蛋白，进而用透析和过滤的方法去除血清γ球蛋白中的盐类物质，得到免疫球蛋白，然后利用这些蛋白质的分子量和理化性质的差异对IgG进行纯化。目前，纯化抗体的方法很多，有辛酸-硫酸铵法、盐析法、凝胶色谱法、离子交换法、亲和层析等。但由于纯化方法不同抗体的效率不同，甚至同一种方法对于不同抗体的效果也存在差异[13-15]。蛋白A亲和层析纯化的抗体纯度高，且蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH，可反复利用，长期不用时用含适量叠氮钠的中性缓冲液平衡后，置于4℃保存即可[16]。本研究选取硫酸铵-蛋白A亲和层析法对IgG进行了纯化，得到了高纯度和高效价的IgG。

[1]耿百成,高丰,贺文琦.猪血凝性脑脊髓炎的研究现状[J].中国畜牧兽医,2005,32（6）:56-58.

[2]周铁忠,李晓卫,李永深,等.辽宁省猪血凝性脑脊髓炎流行病学调查与分析[J].中国农学通报,2009,25（18）:13-17.

[3]兰云刚,赵魁,王改丽,等.靶向S基因siRNA抑制猪血凝性脑脊髓炎病毒在N2a细胞中复制[J].中国兽医学报,2011,31（3）:303-308.

[4]薛华.哺乳仔猪血凝性脑脊髓炎[J].四川畜牧兽医,2006（1）:51.

[5]周灵芝,王彬,唐志鹏,等.猪血凝性脑脊髓炎的实验室诊断技术及防治[J].畜牧与饲料科学,2011,32（1）:96.

[6]柳松柏,房莉莉.猪血凝性脑脊髓炎的诊断及防制[J].养殖技术顾问,2010（1）:72.

[7]刘海燕,俞宁,张平.猪血凝性脑脊髓炎的诊断与科学防制[J].畜牧与饲料科学,2009,30（7-8）:5-7.

[8]常灵竹,贺文琦,陆慧君,等.猪血凝性脑脊髓炎RT-PCR方法的建立和初步应用[J].中国农学通报,2007,23（9）:15-18.

[9]殷震,刘景华.动物病毒学（第二版）[M].北京:科学出版社,1997.

[10]陈克研,赵传博,贺文琦.猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国生物制品学杂志,2009,22（9）:907-910.

[11]曹军平,阎桂玲,刘秀梵,等.两种简易高效的单克隆抗体提纯方法[J].单克隆抗体通讯,1995,11（2）:52-54.

[12]萨姆布鲁克J,拉塞尔D.分子克隆实验指南（第3版）[M].北京:科学出版社,2002.