张 旭，胡 艳，蒋桂韬，王向荣，李昊帮，戴求仲

（湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131）

鸡蛋是一种营养丰富的食品，是居民主要消费的畜产品之一。鸡蛋中胆固醇的含量较高，约为213mg·个-1，为满足不同人群的需要，低胆固醇鸡蛋等具有一定保健功能的鸡蛋受到人们关注，因而有必要对鸡蛋的胆固醇含量进行分析[1-5]。另外，目前市场上鸡蛋品种繁多，生产者或研究者需要对鸡蛋的营养成分进行分析，从而评定其营养价值，这些都需要有准确的分析鸡蛋胆固醇含量的方法。胆固醇主要存在于蛋黄中，因此，测定鸡蛋中胆固醇含量多以蛋黄为样本进行测定。胆固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，试剂盒法是基于酶法测定胆固醇的原理进行的，比色法一种依据显色反应来分析的传统方法，色谱法是适用范围较广、灵敏度较高的分析方法，而高效液相色谱不需要载气，在使用上较气相色谱和液相色谱-质谱联用的方法简便[6-11]。本试验对液相色谱法、皂化-比色法和试剂盒法测定蛋黄胆固醇的过程和结果进行研究和比较，为鸡蛋胆固醇含量测定工作提供方法指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛋黄由市售新鲜鸡蛋中取出；胆固醇标准品，纯度≥99.7%（由中国计量科学研究院提供）；总胆固醇试剂盒（酶法）由北京北化康泰临床试剂有限公司提供；显色液为FeSO4-冰乙酸-浓硫酸，将Fe⁃SO4100mg溶于1mL蒸馏水中，再加入100 mL冰乙酸混合溶解，然后与100 mL浓硫酸缓慢混匀，冷却后使用。

1.2 试验方法

1.2.1 HPLC法

取新鲜蛋黄稀释液（浓度为0.1 g·mL-1）1.0 mL于10 mL离心管中，加入95%乙醇1.0 mL，用漩涡振荡器混匀后，加入乙醚2.5 mL，再次混匀后加入石油醚2.5 mL，震荡混匀，3000 rpm离心5 min，移出上层萃取液，在低于45℃下用氮气吹干，加无水乙醇溶解残余物2.0 mL，用0.45 μm有机微孔滤膜过滤后进样。色谱条件为色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；流动相：乙腈-异丙醇（4∶1，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。取胆固醇标准品用色谱级无水乙醇溶解配成浓度为1mg·mL-1的标准液，取标准液稀释成不同浓度（0～1000 μg·mL-1），以胆固醇浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标制作标准曲线。采用外标法定量分析样品中胆固醇含量。

1.2.2 皂化-比色法

称取鲜蛋黄100mg于25 mL试管中，加入KOH-甲醇溶液5 mL（200 g·L-1），漩涡震荡混匀，置于80℃水浴恒温振荡器中皂化10 min，取出冷却至室温，加入正己烷10 mL，漩涡震荡混匀，静置，将上层液体移入10 mL离心管中，3000 rpm离心10 min，取出上清液60℃下用氮气吹干。然后加入冰乙酸1 mL溶解残余物，再加入显色液3 mL于60℃水浴15 min，在490 nm下用722分光光度计进行比色分析，同法做空白样。将胆固醇标准品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液，取不同体积胆固醇标准品溶液与样品做同样处理，以胆固醇浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作工作曲线。根据样品的吸光度值计算样品中胆固醇含量。

1.2.3 试剂盒法

样品前处理方法同1.2.1，根据试剂盒说明将样品与工作液混合，37℃保温5 min后，在波长500 nm处比色测定吸光度值，并根据样品管和校准管的吸光度值及校准品浓度计算胆固醇含量，计算式见式（1）。

1.2.4 加标回收率的测定

量取0.1 g·mL-1新鲜蛋黄稀释液0.5 mL或新鲜蛋黄50mg，加入1mg·mL-1的胆固醇标准液750 μL，按照上述3种方法进行处理并分析，根据结果计算加标回收率。计算公式见式（2）。

其中，a为测得加标样中胆固醇的量，b为样品中胆固醇的量，c为加标量。

1.3 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 16.0统计软件进行数据处理和分析，结果以“平均值±标准误”表示。

2 试验结果

2.1 HPLC法测定蛋黄胆固醇含量

样品的高效液相色谱图见附图。

由附图可知，胆固醇的保留时间为14.662 min。

2.2 测定结果比较

3种方法测定结果见附表。

通过对3种方法的比较发现，HPLC法的测定结果低于皂化-比色法，但差异不显著（P＞0.05），而试剂盒法的测定结果较HPLC法高（P＜0.05），这与Nogueira的结果相一致[12]。

附图 样品的液相色谱图

附表 3种测胆固醇方法比较%

目前我国产胆固醇试剂盒均为血清总胆固醇试剂盒，其测定原理是胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成胆甾烯酮，再与氨基安替吡啉反应生成红色醌化物，醌化物颜色深浅与胆固醇含量成正比，试剂盒法测定结果较高的原因可能是蛋黄中固醇以外的甾醇类物质也同氨基安替吡啉反应生成有色物，使测定结果偏高[13]。HPLC法测定蛋黄胆固醇结果的偏差最小，方法的重现性和再现性也好于其他两种方法，因而HPLC法的精密度较高。皂化-比色法的偏差较大，其原因可能是此法采用皂化、显色等多步操作，增加了由仪器、试剂和操作等方面带来的系统误差，另外，蛋黄中胆固醇以外的物质也可能与硫酸反应而生成有色物，给测定结果带来干扰。试剂盒法的精密度最低，这可能与蛋黄样品中干扰物质较多有关。在样品中加入胆固醇标准品分析加标回收率的结果表明，HPLC法的回收率最好，因而准确度最高，皂化-比色法居中，试剂盒法的准确度最低。皂化-比色法的加标回收率偏低，可能与胆固醇皂化不完全有关，皂化时间短，样品中胆固醇未能被完全皂化，但皂化时间长又可能会使样品中增加胆固醇以外的皂化产物而干扰测定结果。试剂盒法的加标回收率偏高，一方面与甾醇干扰有关，另一方面，本研究采用手工量取试液在722分光光度计上进行分析，而非全自动机器操作，增大了系统误差。

3 讨论

这3种测定方法中HPLC法以其高效、高速、高灵敏度的特点成为测定蛋黄胆固醇含量最准确的方法，皂化-比色法检测虽然不需要昂贵的仪器，但显色液使用浓硫酸配制，使用和分析过程中有一定危险，且蛋黄中干扰物质多使测定的结果偏差较大[14]。在采用皂化-比色法分析时，为了提高结果的准确性，本研究用胆固醇标准品制作工作曲线而非标准曲线，即将胆固醇标准品做皂化和提取处理，然后加入显色液，整个处理过程与样品相同。目前我国产胆固醇试剂盒均为血清总胆固醇试剂盒，用试剂盒测定血清胆固醇的方法已被广泛使用，但用血清总胆固醇试剂盒测定蛋黄胆固醇含量存在结果偏高，偏差大的问题。谭观岳等在对鳗鱼的试验中也得到相似的结论，另有研究者将气相色谱法测定的结果与试剂盒法比较发现，试剂盒法的测定结果也偏高，而色谱法能够将胆固醇和其他甾醇有效的分离，准确度高[15-16]。

采用HPLC法测蛋黄胆固醇应使用新鲜蛋黄，不宜使用冷冻蛋黄样品，蛋黄冷冻后会发生凝胶化而很难均匀分散在水中；样品处理后用0.45 μm滤膜过滤至EP管中，应尽量将EP管装满，以避免胆固醇与氧气接触而发生氧化；样品前处理时萃取液采用氮吹仪吹干，亦可用真空干燥箱低温烘干；流动相要脱气，测样时保持柱温恒定，避免保留时间偏移。

4 结 论

高效液相色谱法测定蛋黄胆固醇含量，方法可靠、准确、简便，重现性和再现性好。皂化-比色法的准确性较HPLC法低，较试剂盒法高。用总胆固醇试剂盒测定蛋黄胆固醇含量的结果偏高，不建议使用血清总胆固醇试剂盒来测定蛋黄的胆固醇含量。

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