陈 娟，方热军，李美君，项智峰

（湖南农业大学动物科技学院，长沙 410128）

磷在细胞生物学中起关键作用，许多细胞过程包括核酸合成、代谢、能量代谢、细胞信号、膜的完整性、肌肉的功能、酶的活性、脂质的代谢和骨的矿化都需要磷或者磷的其他形式。由于磷在动物体内的重要作用，饲料和饲料添加剂中磷的添加量越来越多，而单胃动物对植酸磷的利用率很低，大部分植酸磷随排泄物排出。规模化畜禽养殖业中过量磷的排泄所导致的环境污染，已成为全球关注的热点问题。

有学者对猪禽粪尿氮磷排放量的分析结果表明，我国目前猪禽粪尿氮年排放总量为213.1万t，养殖业及农村畜禽粪尿污染己成为农业面源污染的主要来源。由此可见，合理添加饲料中磷，减少过量磷排泄导致的生态环境污染问题已成为磷在畜牧生产应用中丞待解决的难题，提倡低磷耗养殖已成为畜牧业可持续发展的重要方向之一。因此，进一步掌握动物对磷吸收的机制，研究比较不同动物磷代谢调控的差异比较，是进行低磷养殖的重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验一，选择体重约1.5 kg 60日龄的三黄肉鸡40只，随机分为A、B、C、D 4个组，4组日粮磷水平依次为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，其中B组为对照组（所有试验组日粮中钙∶有效磷均为2∶1），每组5个重复，每个重复2只鸡（1个代谢笼）。试验二，选用120只平均体重为18～22 g，21日龄的雄性昆明大白鼠，随机分成A、B、C、D 4个组，4组日粮总磷水平依次为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，其中C组为对照组，每组5个重复，每重复6只大白鼠。

1.2 试验日粮

三黄肉鸡和大鼠试验日粮分别按照“中国肉鸡饲养标准”和“大白鼠的营养需要”配制。日粮组成及营养水平见表1、2。

表1 肉鸡日粮组成及营养水平

1.3 样品收集与制备

试验设预试期3 d和正试期7 d，试验期末屠宰所有试验动物，取动脉血3000 rpm离心后置血清于-20℃冰箱保存，备测血钙和血磷；迅速截取十二指肠、空肠和回肠，将肠道内食靡排出后用生理盐水清洗，经液氮处理后分装包好迅速置于-80℃冰箱，待用。

表2 大白鼠基础日粮组成及营养水平

1.4 血磷和血钙的测定

血钙的测定采用偶氮胂Ⅲ法；血磷的测定采用还原钼蓝法；试验数据采用EXCEL初步整理后使用统计分析软件SPSS 17.0进行处理和方差分析，结果以“平均值±标准误”表示。

1.5 小肠各段NaPi-Ⅱb的测定

RNA的提取按照美国Invitrogen公司提供的Trizol试剂的使用说明书操作；cDNA第一链的合成参照上海生工公司提供的Taq酶使用说明书操作。分别根据鸡GenBank收录的鸡NaPi-Ⅱb基因序列（NM_204474），β-actin基因序列（NM_205518）和已知的大鼠（AF157026）CDS保守序列设计，使用Primer Premier 5.0进行引物设计，引物合成由上海生物工程公司完成。引物序列为：

反应体系为：上下游引物（10μmol·L-1）各 0.3 μL，1×qPCR mix 5 μL，50×ROX 0.2 μL， DNA 溶液0.5 μL，加灭菌蒸馏水至10 μL。循环反应条件为：95℃预变性60 s，95℃PCR变性15 s，60℃下延伸30 s，退火温度60℃，40个循环。

2 试验结果

2.1 日粮磷水平对血磷和血钙的影响

日粮磷水平对血磷和血钙的影响见表3。

表3 日粮磷水平对血磷和血钙的影响mg·L-1

由表3可知，随着日粮总磷水平的提高，鸡和大鼠血清磷的含量都呈上升趋势，在0.4%时血清磷最低，1.0%时最高，且两者0.4%与0.6%、0.8%和1.0%磷水平之间皆差异极显著（P＜0.01）。试验鸡血清钙含量随日粮总磷水平的提高而下降，在4个磷水平间差异极显著（P＜0.01）。试验大鼠血钙随日粮总磷水平的提高而升高，但各组间差异均不显著（P＞0.05）。

2.2 日粮磷水平对肠段NaPi-Ⅱb mRNA表达的影响

日粮磷水平对不同肠段NaPi-Ⅱb mRNA表达量的影响见附图。

附图 磷水平对不同肠段NaPi-Ⅱb mRNA表达量的影响

本试验通过Real-time PCR研究显示，不同磷水平显著影响大鼠和肉鸡各肠段中NaPi-Ⅱb mRNA相对表达量（P＜0.05）。大鼠日粮磷含量0.2%水平组与正常磷水平组比较，回肠、空肠、十二指肠NaPi-Ⅱb mRNA表达量最高，随着日粮磷水平的提高，空肠和十二指肠NaPi-Ⅱb mRNA表达量明显降低，回肠NaPi-Ⅱb mRNA表达量当日粮磷含量从0.2%升至0.4%时显著降低，但是当日粮磷含量从0.4%升至0.8%时，NaPi-Ⅱb mRNA表达量无显著变化。此结果与对大鼠、小鼠和虹鳟研究结果相一致，即高磷饲粮降低肠道NaPi-Ⅱb mRNA表达量[1-3]。在肉鸡试验中，空肠中NaPi-Ⅱb mRNA，在磷含量0.4%水平日粮时组中表达最高达1.88，是磷含量1.0%水平日粮组的427%，但是在回肠和十二指肠内未出现显著升高趋势，只是在1.0%水平日粮组中，回肠和十二指肠内NaPi-Ⅱb mRNA的表达量最低。可见低磷提高了小肠中NaPi-Ⅱb mRNA的表达，高磷抑制小肠中NaPi-Ⅱb mRNA的表达；不同磷水平对不同动物不同的组织部位中NaPi-Ⅱb mRNA影响不同，大鼠和肉鸡空肠均随着日粮磷水平的提高NaPi-Ⅱb mRNA表达量降低，回肠和十二指肠内未出现显著降低趋势。

3 讨论

3.1 不同磷水平日粮对动物血磷的影响

随着日粮磷水平的减少，会引起机体内磷离子的一系列变化，机体组织内磷离子的吸收和保留要加强，相反磷的排出就会减少；当日粮中磷水平升高时，机体内磷离子的反应相反。细胞或者多细胞器官可以通过特殊的磷感受体感受到细胞外磷离子的变化[4]。反过来这种感受体通过改变细胞内蛋白的磷酰基位置来改变该蛋白反应机制，受基因控制的蛋白质的合成加速了细胞和细胞磷感受体组成。

血磷的浓度影响FGF-23、sFRP-4、IGF-Ⅰ等影响磷吸收因子的水平，而这些因子的水平又调节肾脏的重吸收。不过关于这种说法，目前还存在争议[5]。饲喂低磷日粮动物体内血磷的降低会引起血钙浓度的升高，而血钙浓度的升高会限制PTH的释放，从而减少肾脏内磷离子的排出。磷离子的浓度可能会直接影响到PTH的释放。低磷日粮或血磷浓度的降低刺激1,25（OH）2D3的合成，1,25（OH）2D3的合成与PTH的无关。相反当饲喂高磷日粮时血钙浓度降低，PTH的浓度升高。由于磷离子对细胞功能的重要性，一系列机制参与调节磷离子的平衡。饲喂低磷日粮动物排泄物中磷的含量会减少，这是对磷缺少以及PTH少量的一种调节[6]。有试验研究发现，日粮磷水平0.4%与0.6%、0.8%相比对野猪血清钙水平影响差异极显著（P＜0.01）；日粮磷水平0.6%与0.8%对血清钙水平影响差异不显著（P＞0.05）。日粮磷水平在0.4%时血清磷最低，0.8%时最高，并且磷水平0.8%与磷水平0.6%日粮血清磷都极显著地高于0.4%磷水平日粮（P＜0.01）。Cromwell等和Coalson等的研究报道也同样证实了这一试验结果[7-8]。

Huber等试验发现，从低磷日粮到高龄日粮肉鸡血磷浓度随着日粮磷的浓度升高而上升，最高达到1 mmol·L-1，低磷日粮组肉鸡血钙浓度显著高于对照组和高磷日粮组，另外，小肠食靡内磷离子浓度随日粮磷浓度增加而上升，钙离子与此相反，在空肠内钠磷转运体容积，NaPi-Ⅱb mRNA表达，血磷浓度和磷的排出彼此不相关[9]。因此，肉鸡空肠内磷的吸收和NaPi-Ⅱb的表达是不受日粮磷浓度调控的。目前关于空肠内NaPi-Ⅱb mRNA表达量随日粮磷含量增加上升的机制还不清楚。

3.2 不同日粮磷水平对NaPi-Ⅱb mRNA表达的影响

小肠是磷吸收的主要部位。早期研究表明，小肠内上皮细胞对磷的吸收是依赖于钠离子。小肠内磷吸收载体主要是NaPi-Ⅱb，其已经在大鼠和人体内克隆。有研究发现大鼠十二指肠和空肠内磷转运体的活性要高于回肠，但是回肠内NaPi-Ⅱb蛋白的表达显著高于十二指肠，而十二指肠BBMV上钠离子依赖式磷转运的活性却比回肠高。低磷日粮饲喂的大鼠空肠BBMV上钠磷转运蛋白的活性比标准日粮或者高磷日粮高67%，但是在十二指肠内没有显著变化。Huber等研究发现，未断奶前的小山羊空肠内钠离子依赖式磷转运体可以根据体内磷离子的平衡调节磷的排出[9]。虽然高磷日粮可以抑制钠离子依赖式磷转运体的数量和活性，但是低磷日粮并不能促进钠离子依赖式磷转运体的数量和活性，十二指肠内磷的转运体是不属于钠离子依赖式磷转运体，其结构及性质还有待研究。空肠内磷的吸收机制是骨化三醇结合细胞核受体后引起的基因机制[10]。和单胃动物一样，山羊空肠内磷的吸收主要是由小肠刷状缘膜上的钠离子依赖式磷转运体的数量决定的低磷日粮同样会促进山羊空肠内Ⅱ型钠离子依赖式磷转运体数量[9]。但是与单胃动物不同的是，低磷日粮促进空肠内钠离子依赖式磷转运体的活性的同时不改变血液骨化三醇的浓度。另外，钠离子依赖式磷转运体的最大结合常数和解离常数等性质不发生改变[11]。同样，高磷日磷虽然会导致PTH目标分子钠离子依赖式磷转运体的减少，但是并不会引起反刍动物PTH浓度的变化[12]。

Murer等研究发现，对空肠和肾脏钠磷转运体的生理调控主要是通过控制转运体的数量[13]。由NaPi-Ⅱb控制的钠离子依赖式磷转运体具有较低的Km值，表现出较好的亲水性。在鸡空肠内钠磷转运体的Km值大概是40 mol·L-1，与其他哺乳动物相似。在鸡肾脏内由NaPi-Ⅱa调节的钠离子依赖式磷转运体的Km值为100 mol·L-1。同哺乳动物一样，鸡体内磷的平衡取决于NaPi-Ⅱ的表达以及钠离子依赖式磷转运体的活性，但是Vmax和NaPi-ⅡmRNA的表达并未受日粮磷水平的限制而明显变化。食靡和血浆磷浓度都没有影响到小肠内磷的吸收。高磷日粮会引起血磷浓度降低而血钙浓度升高。血浆磷离子浓度的升高必然会引起磷排出的升高，这也是降低小肠或者肾脏对磷吸收的主要原因。随着血浆磷离子浓度的升高，肾脏内钠离子依赖式磷转运体Vmax以及NaPi-Ⅱa mRNA的表达显著下降，这也就降低了肾脏对磷的重吸收功能，最后导致排泄物中磷含量增加。但是小鸡空肠内Vmax和NaPi-Ⅱb mRNA的表达量并未随血浆磷离子的浓度有所变化。日粮中总磷的增加会导致磷的排出增加。相关数据表明肾脏内钠磷转运体以及NaPi-Ⅱa mRNA会随血磷浓度降低从而导致磷排出量增加，但是空肠内钠磷转运体以及NaPi-Ⅱb mRNA表达量并未随血磷浓度有所变化。

4 结论

日粮中磷的水平影响NaPi-Ⅱb载体蛋白mRNA表达和磷的摄入量，当饲粮磷水平较低时，NaPi-Ⅱb mRNA表达量随饲粮磷水平升高而有所增加；但是当饲粮磷水平升高到一定程度时，会抑制NaPi-Ⅱb mRNA表达；NaPi-Ⅱb载体蛋白mRNA表达量在不同动物不同部位有所不同，在大鼠小肠不同肠段中磷吸收高低依次为回肠、空肠、十二指肠，在肉鸡不同肠段中磷吸收高低依次为十二指肠、空肠、回肠，日粮添加总磷水平0.4%有利于提高磷利用率。

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