乔芳 石翠英 何路军 王振雷 赵志弘 刘敬闪 张虹 田亚娟

到目前为止，Rh血型系统是国际输血协会(ISBT)已确认的29个红细胞血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，主要包括 D、E、C、c、e 5 种抗原，D 抗原(ISBT004.001;RH1)的免疫原性最强，是临床上引起新生儿溶血病、溶血性输血反应的最重要的血型抗原［1］，其在红细胞上质和量的改变可产生弱D、部分D和Del型，统称为D变异型［2］。决定人类RH血型的RHD/CE基因位于染色体1p34.3～36.1，包括D基因和CE基因，分别由10个外显子组成，编码区总长均为1251bp，分别编码417个氨基酸组成的糖蛋白:D抗原和CcEe抗原。任何座位上的基因突变都可能改变抗原的蛋白结构［3］。通常RhD抗原的确认方法为抗人球蛋白(AHG)试验，但现已证实经抗人球蛋白试验鉴定的RhD阴性个体中存在RhD弱表现型:RhDel型。Del表型是一种变异的极弱RhD阳性血型，会引起Rh阴性受血者产生抗D抗体，因此，对于包括Del在内的极弱Rh阳性表型的研究成为热点。本研究采用吸收放散试验检测D抗原，鉴定出RhDel，再观察D基因存在情况。

1 材料与方法

1.1 材料 河北地区随机抽取2008至2010年期间河北省血液中心汉族RhD阴性献血者血样332份，无亲缘关系。

1.2 血清学实验 按照中国输血技术操作规程确定所有样本的RhD、C、c、E、e抗原。3批抗-D血清来源:上海血液生物医药有限公司、德国BIOTEST公司、美国IMMUCOR公司。使用间接抗人球蛋白试验排除血样中的弱D和不完全D表型。剩余样本通过吸收放散实验筛选Del表型［4］。

1.3 Rh吸收放散实验 IAT阴性样本用乙醚做吸收放散试验，以确定是否为Del型。

1.4 基因组DNA提取 严格按照TIANGEN血液基因组DNA纯化试剂盒说明书操作，提取基因组DNA，紫外分光光度计检测OD260/OD280以确定DNA浓度及纯度。置于－20℃保存。

1.5 RhD基因特异性外显子的PCR检测

1.5.1 序列特异性引物(sequence specific primers，SSP)设计:根据文献Maaskant-van等［5］设计的RHD基因PCR引物体系，对 RHD 基因第3、4、5、6、7、9 特异性外显子进行等位基因特异性PCR扩增，另合成内对照引物HGH(human growth hormone，HGH)，引物由上海生工公司合成。见表1。

表1 RHD特异外显子及1227A的PCR-SSP引物序列及反应特异性

1.5.2 PCR 检测:每个 PCR 反应体系的总体积为 10 μl，含有90 ng/μl基因组 DNA，10 pmol/μl dNTPs，25mM MgCl2，内对照引物 5 pmol/μl，RHD 基因特异性外显子引物 10 pmol/μl，5 U/μl GoTaq Flexi DNA 聚合酶(Promega，Madison，WI，美国)。PCR 反应流程为 95℃ 2 min，95℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环，最后72℃ 10 min。PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照观察结果。

1.6 RhD基因序列分析

1.6.1 PCR扩增:扩增/测序引物序列见表2(扩增/测序相同)。RHD基因EXON1-10共10孔，每孔50 μl dNTP-Buffer工作液中加入0.5 μl Taq 酶(5 U/μl)，再加入 5 μl样本 DNA，1 μl扩增引物(引物终浓度为 0.2 μmol/L)混匀。按以下循环参数进行 PCR扩增:96℃ 2 min，1 cycle;96℃ 20 s/68℃ 60 s 5 cycles;96℃ 20 s/64℃ 50 s/72℃ 1.5 min，10 cycles;96℃20 s/61℃ 50 s/72℃ 1.5 min，25 cycles;72℃ 5 min，1 cycle。每孔再加入15～20 μl石蜡油，盖好反应管。将引物板放入已经设置好参数的PCR仪内，并启动PCR程序，直到循环结束。按照一定的顺序，将每个PCR反应产物转移到已经准备好的1%琼脂糖凝胶系孔中，140～150 V电泳15～20 min。观察条带的特异性扩增效果。

1.6.2 测序反应:用胶提取试剂盒纯化PCR产物进行测序反应，测序反应体系:BigDye v3.1 混合液 16 μl、PCR 纯化产物4 μl。测序反应条件:96℃ 变性 20 s、50℃ 退火 30 s、60℃ 延伸2 min进行25 cycles;4℃保温。使用ABI基因测序仪进行测序，测序结果使用Chromas2.31软件阅读测序图谱进行分析。

表2 PCR扩增RHD10个外显子与测序引物序列

2 结果

2.1 血清学分析 332例经IAT确认的Rh阴性样本中各表型分布为ccee 152例，Ccee 129例，ccEe 20例，CCee 18例，CcEe 11例，ccEE 2例;检出RhDel型72例(21.7%)。见表3。

表3 RhD吸收放散试验阴性个体中Rh表型和RhD基因外显子分析 例

2.2 RhD基因特异性外显子检测 332例经IAT确认的Rh阴性样本中，检出RHD基因83例(25%):RHD基因外显子完整79例，其中Ccee 62例、CCee 8例、ccEe 5例、CcEe 4例，部分缺失4例，其中Ccee 2例，CCee 2例。

图1 PCR-SSP结果图

2.3 RhDel基因型检测 79例 RHDel型样本中，检出RHD1227A基因73例，非RHD1227A基因型6例。见图2。

图2 检测RHD(K409K)等位基因的PCR-SSP结果

2.4 RhD全部外显子测序分析 6例非RHD1227A的样本进行10个RHD外显子的序列测定，均发现两条RH基因都在第五外显子的711缺失一个C，为RHD 711Del，形成移码突变。见图 3、4。

图3 正常RHD基因第5外显子和该例标本有缺失基因的部分序列图谱

图4 正常RHD基因第8内含子和该例标本有突变基因的部分序列图谱

3 讨论

1984年，日本学者Okobo在RhD阴性献血者中发现一种非常弱的RhD抗原表达型，命名为Del表型。其非常弱的RhD抗原无法用敏感的间接抗人球蛋白试验检出，而只能通过吸收放散试验才可检测出来。此型主要存在于中国和日本人群［6］，据报道台湾地区汉族RhD阴性人群中约32.6%为Del型［6］，香港为 20% ～30%［7］，日本仅有 10%［8］。本研究中，332 例RhD阴性献血者的Rh表型以ccee和Ccee频率最高，而CCee和ccEe较低，CcEe及ccEE最低;用吸收放散试验确认的332例RhD阴性样本中进一步检测出83例Del型个体(25%)，与其他研究亚洲人Del型比例的报道数据相近。本组72例RhD吸收放散试验阴性个体中有5例为cc型，提示RhD阴性个体携带RHD基因与RhC抗原之间并无恒定关系。

RHD基因与编码C、c、E、e抗原的RHCE基因具有极高的同源性(约96%)，其间仅有40个核苷酸不同，这40个核苷酸分别位于 RHD 和 RHCE基因第3、4、5、6、7、9外显子。因此在PCR试验中，扩增引物的3’末端均是RHD特异性碱基，可准确检测RHD基因的完整性［9］。RHD基因具有多态性，使Rh血型系统中产生了许多D变异的亚型。Del表型就是其中非常特殊的一种。人们发现Del表型个体存在几乎完整的RhD基因，在Del型是否归于RhD阴性这一点上并没有形成共识。在日常实践中，带有Del表型的个体经常遇到且不被认定为Rh阳性。因此，Del型血液会经常输注给Rh阴性患者但几乎没有引起原发的输血反应。最新的几项研究报道了RhD阴性患者接受了Del血型个体的血液后产生了免疫抗D抗体。目前在不同人种中已发现多种Del的等位基因［10－16］。83例Del型个体中，有79例Del型均携带RhD完整基因，鉴于Del表型在中国汉族人RhD阴性人群中比例较高，因而研究其分子机制、抗原表达和免疫对临床输血意义重大。对该79例Del型样本进一步进行 PCR-SSP检测，发现有73例 Del型均携带 RHD(K409K)等位基因，研究结果和台湾地区报道的一致，即主要由RHD1227A等位基因引起;另外6例非RHD(K409K)样本，采用扩增RHD基因第1-10外显子及测序引物，与正常外显子序列进行比对，发现6例均为两条RH基因在外显子5的711缺失一个C，为RHD 711Del，710-712的CCG变成为CGT，形成移码突变所致，并同时检测到在内含子8的4779的位置处存在一个纯合突变，即4779C/T，而外显子9未发现异常，该结果在河北地区属首次报道。另外该种Del表型的分子背景中，是否第5外显子的缺失与第8内含子的纯合突变同时存在，还需要进一步扩大研究样本。

目前，世界上至少发现了2例真正的Rh阴性受血者由于输入Del表型血液，而产生抗D的病例［17］。在血清学试验中，鉴定Del型的吸收放散试验较繁琐，而且受多种因素制约，因此实验结果可能会难以判断，本研究中通过比较血清学的吸收放散试验和RhD基因特异性外显子检测试验结果证明血清学试验有11例Del漏检。所以应进一步研究Del型分子机理，建立简便准确的基因定型方法，作为确认Del型的理想替代方法。本研究结果表明利用碱基多态性设计序列特异性引物，建立简易的PCR-SSP方法是一种检测Del表型的可行途径。

1 Eli Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system:a review.Blood，2000，95:375-387.

2 Okuda H，Suganuma H，Tsudo N，et al.Sequence analysis of the spacer region between the RHD and RHCE genes.Biochem Biophys Res Commun，1999，263:378-380.

3 徐群，张世训，张建业，等.中国汉族群体RhD阴性个体D基因外显子多态性研究.中华医学遗传学杂志，2001，18:39-42.

4 Ministry of Public Health，the People’s Republic of China.The operation regulation of China transfusion technique(portion of blood center).3rded.Tianjin:Tianjin Kexue Jishu Publications，1997.60-86.

5 Maaskant-van Wijk PA，Faas BHW，de Ruijter JAM，et al.Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons.Transfusion，1998，38:1015-1021.

6 Sun CF，Chou CS，Lai NC，et al.RHD gene polymorphisms among RhD-negative Chinese in Taiwan.Vox Sang，1998，75:52-57.

7 Mak KH，Yan KF，Cheng SS，et al.Rh phenotypes of Chinese blood donors inHong Kong，with special reference to weak D antigens.Transfusion，1993，33:348-351.

8 邵超鹏，苏宇清，吴国光，等.中国人群真实RhD阴性个体和RhDel型RHD基因研究.华中科技大学学报(医学版)，2002，31:501-504.

9 李勤，叶璐夷，郭忠慧，等.中国人群中Del表型分子背景研究.中华医学遗传学杂志，2006，23:486-491.

10 Singleton BK，Green CA，Kimura K，et al.Two new RHD mutations associated with the Del phenotype.Transfus Clin Biol，2001，8:9s.

11 Wagner FF，Frohmajer A，Flegel WA.RHD positive haplotypes in D negative Europeans.BMC Genet，2001，2:10.

12 Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al.Molecular background of Rh D-positive，D-negative，D(el)and weak D phenotypes in Chinese.Vox Sang，2002，83:156-161.

13 Chen JC，Lin TM，Chen YL，et al.RHD 1227A is an important genetic marker for RhD(el)individuals.Am J Clin Pathol，2004，122:193-198.

14 Gassner C，Doescher A，Drnovsek T，et al.Presence of RHD in serologically D-，C/E+individuals:a European multicenter study.Transfusion，2005，45:527-538.

15 Kormoczi GF，Gassner C，Shao CP，et al.A comprehensive analysis of DEL types:partial DEL individuals are prone to anti-D alloimmunization.Transfusion，2005，45:1561-1567.

16 Wagner T，Kormoczi GF，Buchta C，et al.Anti-D immunization by DEL red blood cells.Transfusion，2005，45:520-526.

17 Yasuda H，Ohto H，Sakuma S，et al.Secondary anti-D immunization by Del red blood cells.Transfusion，2005，45:1581-1584.