姬宏莉，姬宏娟，马永全，杜 芳，王 辉

肿瘤的发生不仅取决于核内遗传物质，而且还与核外的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）密切相关[1，2]。mtDNA是细胞内唯一的核外遗传物质，具有可自主复制的DNA基因组。mtDNA是具有编码区和非编码区共16 569个碱基对的双链闭环分子，其中编码区含有37个基因，2种rRNA，22种tRNA和13种与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白多肽基因；非编码区由 1120bp（16025-576）的 D环（D-Loop）构成[3]。多项研究发现mtDNA的D环可能为mtDNA突变的热点所在,但不同的实体肿瘤，有关该区突变的频率报道存在明显差异[4]。本实验通过将大肠癌细胞突变的mtDNA片断转染NIH3T3细胞，观察NIH3T3的突变和多态性变化，以便明确变异的mtDNA造成肿瘤发病的机制和作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；mtDNA提取试剂盒购自杭州V-gene生物科技公司；2×Pfu PCR MasterMix购自北京TianGene生物科技公司。Lipofection2000TM转染试剂购自Invintrogen公司。

1.2 实验用细胞株及质粒 ①NIH3T3细胞株购于南方医院病理生理教研室；②大肠癌mtDNA的重组表达载体：在 pcDNA3.1（+）载体 BamH I，Xho I位点间插入1200bp的突变的大肠癌mtDNA的D环区，命名为 pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA，pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA，由本课题组构建。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 NIH3T3细胞在37℃，5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养，培养基为含10%进口胎牛血清（GIBCO）的DMEM高糖培养基，隔天换液1次，每4～5 d用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.3.2 细胞转染与筛选 转染前24 h将处于对数生长期的NIH3T3细胞消化计数，调整浓度为1×105个/ml，接种于六孔板中，用Lipofection2000TM将pcDNA3.1（+）-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1（+）-Lovo mtDNA分别导入NIH3T3细胞，具体转染操作过程参考 Invintrogen公司的Lipofection2000TM说明书及相关文献[5]。置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后更换无抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，48 h后用 G418 200 μg/ml筛选，2周后挑选单克隆细胞群落，用含G418 100 μg/ml的培养基继续培养。……