王发祥，刘永乐，丁学知，夏立秋

（1.长沙理工大学化学与生物工程学院，长沙 410114；2.湖南师范大学生命科学学院微生物分子生物学湖南省重点实验室，长沙 410081)

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是世界上应用范围最广的杀虫微生物，其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白。苏云金杆菌毒蛋白的杀虫机理已基本明确，描述如下：晶体蛋白被敏感昆虫吞食后，在碱性的中肠环境中很快被蛋白酶激活为活性毒素，然后结合到中肠上皮细胞的特异受体上，毒素随后发生构象变化并插入中肠膜，形成离子通道的孔，暴露在毒素中的中肠上皮细胞由于渗透平衡破坏而最终裂解死亡，并导致虫体的死亡[1-2]。目前，对苏云金杆菌Cry毒蛋白的结构与功能研究已成为一个热点，但国内在相关领域的研究，受Cry蛋白的纯化技术的制约，远落后于国际水平。

Cry蛋白是苏云金杆菌在芽胞形成期产生的一种伴胞晶体蛋白，只有活化后才具有特异的杀虫活性，其原毒素通常和20 kb DNA结合在一起[3]，因此很难用分子筛层析纯化。另外，我们发现，用离子交换层析也无法纯化获得Cry蛋白原毒素，这很可能与Cry蛋白和20 kb DNA分子表面电荷分布复杂有关。基于此，我们提出了一种以等电点沉淀法纯化Cry1Ac蛋白原毒素，进而用分子筛层析纯化其活性的毒素片段的方法，为进一步研究Cry蛋白的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

BH-2型显微镜（日本Olympus公司）；AKTA purifier 100 system（美国 GE Healthcare）；DYY－Ⅲ－6B型电泳仪（北京六一仪器厂）；……